学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

还原力产生酶对大肠杆菌脂肪酸合成的影响

作　者: 周永双
导　师: 陈永泉
学　校: 江南大学
专　业: 食品科学
关键词: 大肠杆菌脂肪酸合成还原力 NAD+依赖型苹果酸酶 NADP+依赖型苹果酸酶 NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 49次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

还原力是脂肪酸生物合成中的重要因素，脂肪酸链在不断延长的过程中，还原反应的持续进行必须有还原力的供应。细胞中多种产生还原力的酶，包括NADP+依赖型苹果酸酶（NADP-ME）、NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶（NADP-IDH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）及NAD+依赖型苹果酸酶（NAD-ME）所催化的反应都是脂肪酸合成中还原力的潜在来源。但这五种还原力产生酶在细菌脂肪酸合成中分别发挥着怎样的作用是不明确的。本论文以大肠杆菌为研究的对象菌，通过过表达其内源的NAD-ME、NADP-ME、NADP-IDH、G6PD、PGD五种还原力产生酶，测定过表达菌株的总脂肪酸产量，探讨这五种酶对大肠杆菌脂肪酸合成的影响。首先在大肠杆菌BL21中，分别过表达NAD-ME、NADP-ME、NADP-IDH、G6PD和PGD五种酶，获得了五种还原力产生酶的过表达菌株ZY2至ZY6。在相同的条件下对各重组菌进行诱导培养20h，收菌时菌株ZY2至ZY6中分别过表达的NAD-ME、NADP-ME、NADP-IDH、G6PD、PGD的活性增加至对照菌株ZY1的19倍、37倍、3倍、315倍和52倍。而菌株ZY2至ZY6的总脂肪酸产量较对照菌株ZY1均未提高，且向培养基中添加一定浓度范围的各自底物，菌株ZY3、ZY4、ZY5的总脂肪酸产量与不添加底物相比仍无显著性变化。因此，在非产脂的野生型大肠杆菌BL21(DE3)中过表达还原力产生酶并不能提高其脂肪酸产量，BL21(DE3)不适合作为本研究的宿主菌。菌株BL21(DE3)及ZY1至ZY6中主要含有8种脂肪酸：C12:0，C14:0，C16:0，C16:1，C17:0△，C18:0，C18:1和C19:0△。随后构建了具备积累脂肪酸能力的大肠杆菌BL21△fadE/pTE，并将其作为新的宿主菌，分别过表达NAD-ME、NADP-ME、NADP-IDH、G6PD和PGD五种酶，获得了五种还原力产生酶的过表达菌株YS2至YS6。在相同的条件下对各重组菌进行诱导培养20h，收菌时菌株YS2至YS6中分别过表达的NAD-ME、NADP-ME、NADP-IDH、G6PD、PGD的活性增加至对照菌株YS1的2倍、826倍、11倍、96倍和14倍。菌株YS2至YS6的总脂肪酸产量呈现出明显的差异：菌株YS2（过表达NAD-ME）、YS5（过表达G6PD）、YS4（过表达NADP-IDH）的总脂肪酸产量分别提高至对照菌株YS1的2.15倍、1.6倍、1.16倍，而菌株YS6（过表达PGD）的总脂肪酸产量与对照菌株YS1无显著性差异，菌株YS3（过表达NADP-ME）的总脂肪酸产量呈现15%的下降。菌株YS1至YS6除合成ZY系列菌株中存在的8种脂肪酸外，还合成了C12:1和C14:1两种脂肪酸。与对照菌株YS1相比，菌株YS2至YS6中C12和C14脂肪酸的百分含量显著提高，并且菌株YS2和YS5总脂肪酸含量的增加主要是由C12和C14脂肪酸的增加造成的。上述结果表明，NAD-ME所提供的NADH能够作为大肠杆菌脂肪酸合成中动用的还原力。NAD-ME和G6PD可能在大肠杆菌脂肪酸合成中还原力的提供方面发挥着比NADP-ME、NADP-IDH和PGD更为重要的作用。此结果也为进一步提高工程化大肠杆菌脂肪酸产量提供了一条有效策略——过表达产还原力的酶NAD-ME和G6PD。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章绪论  9-19
  1.1 微生物油脂  9-10
    1.1.1 微生物油脂在食用油中的应用  9-10
    1.1.2 微生物油脂在生物柴油中的应用  10
  1.2 油脂合成中的还原力来源酶  10-13
    1.2.1 油脂合成中还原力 NADPH 的来源酶  10-12
    1.2.2 NADH 作为脂肪酸合成中还原力来源的可能性  12-13
  1.3 大肠杆菌脂肪酸代谢  13-17
    1.3.1 大肠杆菌脂肪酸的合成  13
    1.3.2 大肠杆菌脂肪酸的降解  13-15
    1.3.3 大肠杆菌中不饱和脂肪酸及环丙烷脂肪酸的合成  15
    1.3.4 大肠杆菌脂肪酸代谢的调控  15-16
    1.3.5 大肠杆菌的硫酯酶 I  16
    1.3.6 提高大肠杆菌脂肪酸产量的相关研究  16-17
  1.4 课题研究意义与内容  17-19
    1.4.1 本课题的研究意义  17
    1.4.2 本课题的主要研究内容  17-19
第二章材料与方法  19-30
  2.1 实验材料  19-23
    2.1.1 质粒与菌株  19
    2.1.2 工具酶与试剂  19-20
    2.1.3 培养基  20-21
    2.1.4 常用溶液的配制  21-22
    2.1.5 主要仪器与设备  22-23
  2.2 实验方法  23-30
    2.2.1 引物设计与目的片段的扩增  23
    2.2.2 分子克隆相关实验  23-25
    2.2.3 大肠杆菌重组菌株的摇瓶培养  25
    2.2.4 摇瓶培养菌体的收集和处理  25-26
    2.2.5 SDS-PAGE 蛋白质凝胶电泳  26-27
    2.2.6 还原力产生酶的活性检测  27-28
    2.2.7 脂肪酸的提取与分析  28-29
    2.2.8 统计学分析  29-30
第三章结果与讨论  30-49
  3.1 还原力产生酶基因的克隆及其重组载体的构建  30-32
    3.1.1 还原力产生酶基因的 PCR 扩增  30
    3.1.2 用于过表达还原力产生酶的重组载体的构建  30-32
  3.2 过表达还原力产生酶对大肠杆菌 BL21 脂肪酸合成的影响  32-41
    3.2.1 以大肠杆菌 BL21 为宿主的还原力产生酶过表达菌株的构建  32-33
    3.2.2 IPTG 对大肠杆菌 ZY1 脂肪酸产量的影响  33
    3.2.3 重组菌株蛋白质表达的 SDS-PAGE 分析  33-35
    3.2.4 重组菌株中还原力产生酶的活性分析  35
    3.2.5 重组菌株的脂质分析  35-38
    3.2.6 底物添加对重组菌株脂肪酸产量的影响  38-40
    3.2.7 本节讨论  40-41
  3.3 过表达还原力产生酶对大肠杆菌 BL21△fadE/pTE 脂肪酸合成的影响  41-49
    3.3.1 ‘tesA 基因的克隆及其重组载体的构建  41-43
    3.3.2 以大肠杆菌 BL21△fadE/pTE 为宿主的还原力产生酶过表达菌株的构建  43-44
    3.3.3 重组菌株蛋白质表达的 SDS-PAGE 分析  44-45
    3.3.4 重组菌株中还原力产生酶的活性分析  45
    3.3.5 重组菌株的脂质分析  45-48
    3.3.6 本节讨论  48-49
主要结论与展望  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-54
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  54

还原力产生酶对大肠杆菌脂肪酸合成的影响

内容摘要

全文目录

相似论文