学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

高产油脂红酵母的选育及其NADP依赖型苹果酸酶基因保守片段的克隆

作　者: 徐振杰
导　师: 黄乾明
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 红酵母微生物油脂鉴定诱变培养条件优化气相色谱质谱联用 NADP依赖型苹果酸酶
分类号: TE667
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 84次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

微生物油脂又称单细胞油脂,是指由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下,利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源,在菌体内积累的大量油脂。早期的微生物油脂研究主要集中在γ-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(FPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等功能性油脂的开发上。近年来,随着生物新能源开发利用研究工作的推进,微生物油脂已逐渐成为生物能源开发利用的对象,同时,产油微生物具有资源丰富、油脂含量高、碳源利用谱广和开发潜力大等特点,因此,利用微生物生产油脂已成为开发油脂资源的一个新方向,尤其是在能源极其短缺的今天,开辟这一新的油脂资源显得尤为重要。因此积极选育高产油脂菌株、研究其最佳发酵条件,并从分子层面探索影响油脂积累的关键因素,具有重要的意义。本文系统地研究了一株高产油脂红酵母的筛选鉴定以及其发酵条件的优化,测定了其脂肪酸组成,并通过PCR扩增得到影响油脂积累的关键酶基因—NADP依赖型苹果酸酶基因保守片段的DNA序列及其对应的cDNA序列,为发掘新的油脂微生物资源提供实验依据,也为NADP-ME基因全长的克隆做准备,进而为进一步研究油脂积累代谢调控和采用基因工程方法改进菌株的产油脂能力奠定基础。其主要研究结果如下：1.以本实验室早期从自然界中分离纯化所得到的18株高产类胡萝卜素红酵母菌株为材料,采用苏丹黑染色法初筛、摇瓶法复筛,得到1株脂含量相对较高(14.63%)的菌株SCAU-13;经形态学和生理生化特征鉴定及18SrDNA鉴定,结果显示,该菌株为禾本红酵母(Rhodotorula graminis)。2.以SCAU-13为出发菌株,经紫外诱变、硫酸二乙酯诱变、吖啶橙诱变及其复合诱变,最终得到突变菌株M124,其脂含量达42.42%,为出发菌株的2.90倍；培养条件优化结果表明其最佳产脂条件为：以葡萄糖为碳源,(NH4)2SO4为氮源,碳氮比为60,起始pH6.0,蛋白胨1.8 g/L,酵母粉4 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L。在此条件下,菌体生物量为(13.55±0.10)g/L,脂含量为(53.67±0.17)%,产脂率为(7.27+0.03)g/L,比优化前分别提高了14.83%、26.52%和45.11%。3.采用气相色谱质谱联用法(GC-MS)测定了禾本红酵母菌株M124 (R. graminis M124)菌体油脂的脂肪酸组成,结果显示,在本实验条件下,各种脂肪酸都能够得到较好的分离,且该方法方便、快捷。在R. graminis M124菌体油脂中共检测出8种脂肪酸,其中,饱和脂肪酸为十四烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、二十烷酸,占脂肪酸总量的18.29%；单不饱和脂肪酸为9-十六烯酸、10-十八碳烯酸、9-十八碳烯酸,占脂肪酸总量的81.71%;未检测出多不饱和脂肪酸。其脂肪酸组成的特殊之处在于：10-十八碳烯酸在R. graminis M124菌体油脂中的含量高达80.08%。4.以突变菌株R. graminis M124为研究对象,克隆得到了两种NADP依赖型苹果酸酶N-端结构域的一段DNA序列及其对应的cDNA序列,证明在禾本红酵母(R.graminis M124)中至少存在两种编码NADP依赖型苹果酸酶的基因,同时,也为采用染色体步移法或cDNA末端快速扩增法进一步克隆其基因全长奠定了基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-13
第一章文献综述  13-25
  1 微生物油脂概述  13
  2 微生物油脂的用途  13-15
    2.1 应用于生物柴油  13-14
    2.2 应用于医药  14-15
    2.3 其他用途  15
  3 产油脂的微生物  15-16
  4 高产油脂菌株的筛选  16-17
  5 微生物菌体预处理与油脂提取  17-18
  6 微生物菌体油脂脂肪酸组成  18-19
  7 微生物油脂积累代谢及其调控机理  19-22
    7.1 微生物油脂积累代谢途径  19-21
    7.2 真菌中油脂合成的关键酶—NADP依赖型苹果酸酶  21-22
  8 NADP-ME基因克隆研究进展  22-23
  9 本研究的目的及意义  23-25
第二章高产油脂红酵母的选育、鉴定及培养条件优化  25-47
  1 引言  25
  2 材料与方法  25-33
    2.1 材料  25-28
      2.1.1 供试菌株  25-26
      2.1.2 主要仪器设备  26
      2.1.3 药品与试剂  26
      2.1.4 溶液的配制  26-27
      2.1.5 培养基  27-28
    2.2 方法  28-33
      2.2.1 菌种活化  28
      2.2.2 初筛  28
      2.2.3 复筛  28-29
      2.2.4 菌株的形态学及生理生化特征鉴定  29
      2.2.5 菌株的分子生物学鉴定  29-31
      2.2.6 诱变育种  31-33
      2.2.7 正向突变菌株的筛选及其遗传稳定性测试  33
      2.2.8 发酵条件的优化  33
      2.2.9 数据处理  33
  3 结果与分析  33-45
    3.1 原始菌株的初筛  33-34
    3.2 原始菌株的复筛  34-35
    3.3 菌株SCAU-13的鉴定  35-37
      3.3.1 形态学及生理生化特征鉴定  35-36
      3.3.2 18S rDNA的分子生物学鉴定  36-37
    3.4 诱变剂量的选择  37-39
    3.5 正向突变菌株的筛选  39-40
    3.6 遗传稳定性试验  40
    3.7 菌株M124的发酵条件优化  40-45
      3.7.1 碳源对菌株M124发酵产油脂的影响  40-41
      3.7.2 氮源对菌株M124发酵产油脂的影响  41-42
      3.7.3 C/N对菌株M124发酵产油脂的影响  42
      3.7.4 初始pH对菌株M124发酵产油脂的影响  42-43
      3.7.5 正交试验  43-45
  4 讨论  45-47
    4.1 高产油脂菌株的选育  45-46
    4.2 菌株产脂培养条件的优化  46-47
第三章禾本红酵母M124菌体油脂脂肪酸组成分析  47-51
  1 引言  47
  2 材料与方法  47-49
    2.1 材料  47-48
      2.1.1 供试菌株  47
      2.1.2 主要仪器设备  47
      2.1.3 药品与试剂  47-48
      2.1.4 培养基  48
    2.2 方法  48-49
      2.2.1 培养方法  48
      2.2.2 油脂的提取  48
      2.2.3 油脂的甲酯化  48
      2.2.4 GC-MS试验条件  48-49
      2.2.5 分析鉴定  49
  3 结果与分析  49-50
  4 讨论  50-51
第四章禾本红酵母菌株M124 NADP-ME基因保守片段的克隆及序列分析  51-66
  1 引言  51
  2 材料与方法  51-56
    2.1 材料  51-52
      2.1.1 供试菌株  51
      2.1.2 主要仪器设备  51-52
      2.1.3 药品与试剂  52
    2.2 方法  52-56
      2.2.1 基因组DNA的提取及检测  52
      2.2.2 NADP-ME基因保守片段的克隆  52-54
      2.2.3 总RNA的提取及检测  54-55
      2.2.4 RT-PCR制备3’-末端单链cDNA  55
      2.2.5 NADP-ME基因保守片段cDNA的克隆  55
      2.2.6 DNA序列分析  55-56
  3 结果与分析  56-63
    3.1 NADP-ME基因保守片段的克隆及序列分析  56-58
      3.1.1 NADP-ME基因保守片段的克隆  56
      3.1.2 NADP-ME基因保守片段的序列分析  56-58
    3.2 总RNA的制备  58
    3.3 NADP-ME基因cDNA保守片段的克隆及序列分析  58-61
      3.3.1 NADP-ME基因cDNA保守片段的克隆  58-60
      3.3.2 保守片段BS28-cDNA与BS33-cDNA的序列分析  60-61
    3.4 保守片段BS28与BS33的内含子分析  61-63
  4 讨论  63-66
结论  66-68
参考文献  68-77
致谢  77-78
攻读硕士期间发表的论文  78

高产油脂红酵母的选育及其NADP依赖型苹果酸酶基因保守片段的克隆

内容摘要

全文目录

相似论文