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壳聚糖酶产生菌株的筛选及酶的固定化研究

作　者: 卓少玲
导　师: 陈盛
学　校: 福建师范大学
专　业: 环境科学
关键词: 壳聚糖酶 壳寡糖 酶学特性 固定化
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


从福建沿海泥样中分离得到4株产壳聚糖酶能力较强的菌株,经酶活性检测,菌株M-2产酶能力最强,通过对其产酶发酵条件的研究,确定了其最佳发酵条件为：壳聚糖1.0%,初始pH为6.5,(NH4)2SO41.87%,接种量为4%,装液量为70mL/250mL,30℃下150r.min-1摇床培养72h。在最适产酶培养条件下,菌株M-2发酵液中壳聚糖酶活力最高可达到18U/mL.结合形态学观察及26SrDNA鉴定,确定该菌株为青霉菌属(Penicillium sp.)的一种,命名为Penicillum sp.M-2.纯化后的粗酶液经SDS-PAGE分析显示一条清晰的蛋白条带,确定Penicillum sp.M-2菌株所产的壳聚糖酶的分子量约为40kD.并对Penicillum sp.M-2菌株产壳聚糖酶进行了酶学特性研究,结果表明,该壳聚糖酶酶促反应的最适pH为5.0：最适温度为55℃；在离子浓度为1×10-3mo1/L时,金属离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+对酶的活性具有一定的促进作用,酶活力分别提高了4%,1%,2%,2%: Cu2+、Hg2+、Ag+对酶具有不同程度的抑制作用,酶活分别下降了60%,65%,69%；该酶对不同的底物及不同脱乙酰度的底物壳聚糖降解作用不同；其以水溶性壳聚糖为底物时,酶促反应表观米氏常数Km值为1.293g/L。模拟酶解法制备了三种不同分子量大小的壳寡糖,并进行了初步的抑菌试验,结果表明,浓度为4%、分子量为1215±20.0(聚合度为7)的壳寡糖对玉米大斑病菌(Helminthosporium turcicum Pass)、小麦根腐病菌(Cochlioblus sativus)生长抑制效果最好,抑菌率分别为79.3%、7%。对本研究所获得的纯化后的壳聚糖酶进行了固定化研究,以纳米SiO2改性壳聚糖为固定化载体,并结合扫描电镜、红外光谱及X-射线衍射对固定化载体的表征进行了验证,初步确定固定化酶的最适温度为60℃,最适pH为7.0,表观米氏常数Km’为10.64g/L；研究表明,反应温度、pH、表观米氏常数Km’均较游离酶有所提高。固定化酶具有较强的操作稳定性,重复使用10次后,酶活力下降不低于原始酶活力的70%；固定化酶具有良好的低温保存稳定性,4℃条件下,固定化酶的保存半衰期约为28d。

全文目录


中文摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-7
目录  7-10
绪论  10-26
  1.1 壳寡糖的应用  11-13
    1.1.1 壳寡糖在食品领域中的应用  11-12
    1.1.2 壳寡糖在医药领域的应用  12
    1.1.3 壳寡糖在农业生产中的应用  12-13
    1.1.4 壳寡糖在动物生产中的应用  13
    1.1.5 壳寡糖在日用化学品中的应用  13
  2.1 壳寡糖的制备方法  13-16
    2.1.1 化学降解法  13-14
    2.1.2 物理场降解法  14-15
    2.1.3 生物酶解法  15-16
  3.1 微生物壳聚糖酶的研究  16-20
    3.1.1 壳聚糖酶的发现、分类及来源  16-17
    3.1.2 壳聚糖酶的理化性质  17-20
  4.1 酶的固定化  20-24
    4.1.1 固定化酶概述  20-21
    4.1.2 酶的固定化方法  21-23
    4.1.3 传统的有机无机杂化载体材料的改性概述  23-24
  5.1 本研究的目的、意义、主要内容  24-26
    5.1.1 研究目的  24-25
    5.1.2 研究的意义  25
    5.1.3 主要内容  25-26
第1章 壳聚糖酶产生菌株的筛选及发酵条件优化  26-42
  1.1 壳聚糖酶产生菌株的筛选及最适发酵条件的探讨  26-31
    1.1.1 菌株  26
    1.1.2 菌株的分离和培养  26-27
    1.1.3 溶液和其它试剂  27
    1.1.4 主要仪器  27
    1.1.5 壳聚糖酶活性的测定  27-28
    1.1.6 壳聚糖酶产生菌株的筛选及最适发酵条件的探讨  28-30
    1.1.7 壳聚糖酶产生菌株的26SrDNA鉴定  30-31
  1.2 结果与分析  31-40
    1.2.1 菌株筛选结果  31-33
    1.2.2 氨基葡萄糖标准曲线  33
    1.2.3 M-2发酵产酶条件的优化  33-38
    1.2.4 M-2菌株的26SrDNA鉴定结果  38-40
  1.3 本章小结  40-42
第2章 Penicillium sp.M-2菌株产壳聚糖酶的纯化及酶学特性研究  42-54
  2.1 材料与方法  42-43
    2.1.1 菌种和酶液  42
    2.1.2 试剂和药品  42
    2.1.3 仪器  42
    2.1.4 常用溶液  42-43
    2.1.5 培养基  43
  2.2 方法  43-46
    2.2.1 壳聚糖酶活的测定  43
    2.2.2 蛋白质浓度的测定  43-44
    2.2.3 酶学性质的测定  44-46
  2.3 结果与分析  46-52
    2.3.1 蛋白标准曲线  46
    2.3.2 酶的纯化及分子量测定  46-47
    2.3.3 壳聚糖酶理化性质  47-52
  2.4 本章小结  52-54
第3章 酶解法制备壳寡糖及其抑菌效能的研究  54-62
  3.1 壳寡糖的制备及其对植物病原菌抑制作用  54-60
    3.1.1 材料与仪器  54-55
    3.1.2 实验方法  55-57
    3.1.3 结果与分析  57-60
  3.2 本章小结  60-62
第4章 Penicllium sp.M-2的壳聚糖酶的固定化研究  62-74
  4.1 材料  62-63
    4.1.1 菌种和酶液  62
    4.1.2 试剂  62
    4.1.3 仪器  62
    4.1.4 常用溶液  62-63
    4.1.5 培养基  63
  4.2 方法  63
    4.2.1 壳聚糖酶活的测定  63
    4.2.2 壳聚糖与二氧化硅复合载体的制备  63
    4.2.3 壳聚糖酶的固定化  63
  4.3 结果与讨论  63-73
    4.3.1 载体的制备  63-67
    4.3.2 固定化酶的条件优化  67-71
    4.3.3 固定化酶的稳定性  71-73
  4.4 本章小结  73-74
讨论与建议  74-78
参考文献  78-88
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  88-90
致谢  90-92
个人简历  92-94

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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