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圆酵母B84512产赤藓糖醇发酵条件优化及其GPD1基因敲除

作　者: 高慧
导　师: 许正宏
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 赤藓糖醇 分批补料 圆酵母 酶活 基因敲除 发酵优化
分类号: TS264.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


赤藓糖醇是一种功能性甜味剂，因其具有热量低、人体耐受性高、抗龋齿等特性，而受到业界越来越多的关注。本论文采用分批补料的方式提高圆酵母Torula sp. B84512合成赤藓糖醇产率。发酵过程中发现在赤藓糖醇生成的同时，副产物甘油也大量积聚，敲除副产物甘油代谢流途径中关键酶胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)基因可减少甘油的合成。通过筛选Torula sp.B4512单倍体菌株并构建Torula sp.B4512—7△GPD1菌株及Torula sp.B4512—9△GPD1菌株，继而将两株单倍体菌株杂交形成二倍体Torula sp.B4512—79△GPD1菌株。在此基础上初步比较了3株重组菌与出发菌株Torula sp. B4512的GPD1酶活，分别得到以下结果：(1)采用分批补加葡萄糖的方式提高Torula sp. B84512产赤藓糖醇的能力。设定初始葡萄糖浓度为30%，当残糖降至20%时补加浓度为80%的葡萄糖，控制补加次数使总糖分别达到40%、50%及60%。结果表明，当总糖为50%时，赤藓糖醇浓度最高为253g/L，生产强度为1.03g/(L·h)。对甘油合成代谢途径中酶活测定确定胞浆3—磷酸甘油脱氢酶（同工酶GPD1）为关键酶，可通过敲除该酶编码基因减少副产物甘油的合成。(2)通过产孢培养基筛选Torula sp.B84512单倍体，发酵结果显示3株赤藓糖醇产量相对较高，分别命名为Torula sp.B84512-7、Torula sp.B84512-8及Torula sp.B84512-9。通过PCR方法验证单倍体倍型，结果表明Torula sp.B84512-7、Torula sp.B84512-8为α型，Torula sp.B84512-9为a型。发酵过程中Torula sp.B84512-7合成赤藓糖醇能力优于Torula sp.B84512-8，因此将Torula sp.B84512-7及Torula sp.B84512-9用于后续基因敲除。(3)采用cre-loxp的敲除原理在圆酵母体内进行GPD1基因敲除，成功构建Torulasp.B84512-7△GPD1菌株及Torula sp.B84512-9△GPD1菌株。将两株单倍体重组菌进行杂交得到Torula sp.B84512-79△GPD1，3株重组菌体内GPD1酶活明显低于原始菌，但重组菌对高渗环境的耐受性降低导致在高渗培养基中生长缓慢。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-7
第一章 绪论  7-17
  1.1 赤藓糖醇研究背景  7
  1.2 赤藓糖醇理化性质  7-8
  1.3 赤藓糖醇生理功能及代谢特征  8
    1.3.1 热量低，代谢独特  8
    1.3.2 高耐受量，毒副作用小  8
    1.3.3 抗龋齿性  8
  1.4 赤藓糖醇的应用  8-9
    1.4.1 赤藓糖醇在食品方面的应用  9
    1.4.2 赤藓糖醇在医药行业、保健品行业方面的应用  9
    1.4.3 赤藓糖醇在化工行业、化妆品行业方面的应用  9
  1.5 赤藓糖醇的生产方法  9-10
    1.5.1 化学合成法生产赤藓糖醇  10
    1.5.2 生物合成法生产赤藓糖醇  10
  1.6 赤藓糖醇发酵工艺国内外研究进展  10-11
    1.6.1 国外研究进展  10-11
    1.6.2 国内研究进展  11
  1.7 赤藓糖醇代谢途径  11-13
  1.8 基因工程技术在酵母育种中的应用  13-15
    1.8.1 实验室酵母菌株选育  13
    1.8.2 基因工程育种技术  13-15
  1.9 立题意义及研究内容  15-17
    1.9.1 立题意义  15
    1.9.2 研究内容  15-17
第二章 圆酵母 B84512 发酵产赤藓糖醇发酵条件优化  17-23
  2.1 引言  17
  2.2 材料与方法  17-19
    2.2.1 材料  17-18
    2.2.2 实验方法  18-19
    2.2.3 分析方法  19
  2.3 结果与讨论  19-22
    2.3.1 不同碳源发酵对赤藓糖醇和甘油产量的影响  19-20
    2.3.2 甘油和葡萄糖对圆酵母 B84512 合成赤藓糖醇及甘油的影响  20
    2.3.3 葡萄糖补加对圆酵母 B84512 合成赤藓糖醇及甘油的影响  20-21
    2.3.4 发酵过程中胞浆 3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油酯酶和线粒体 3-磷酸甘油脱氢酶酶活表征  21-22
  2.4 本章小结  22-23
第三章 产赤藓糖醇菌株圆酵母 B84512 的单倍体制备及其 GPD1 基因敲除  23-42
  3.1 引言  23
  3.2 材料与方法  23-34
    3.2.1 材料  23-25
    3.2.2 实验方法  25-34
  3.3 结果与讨论  34-40
    3.3.1 高产孢率培养基的筛选  34
    3.3.2 不同裂解时间对子囊孢子裂解率的影响  34-35
    3.3.3 单倍体的获得  35
    3.3.4 单倍体菌株发酵性能确定  35-36
    3.3.5 单倍体倍型鉴定  36
    3.3.6 酵母基因组提取  36-37
    3.3.7 Torula sp. B84512-7 体内 3-磷酸甘油脱氢酶编码基因扩增  37
    3.3.8 Torula sp. B84512-7 同源片段△GPD1 构建  37-38
    3.3.9 敲除组件 U-Cre-ZeoR-D 的构建及验证  38-39
    3.3.10 基因敲除的 PCR 验证  39-40
    3.3.11 △GPD1 重组菌与出发菌株 Torula sp.B84512 酶活力比较分析  40
  3.4 本章小结  40-42
第四章 结论与展望  42-44
  4.1 主要结论  42
  4.2 展望  42-44
致谢  44-45
参考文献  45-48
附录 1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  48-49
附录 2：核苷酸序列  49

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 酿造工业 > 调味品的生产 > 其他合成调味品
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