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β-D-半乳糖苷酶的发酵生产、分离纯化和性质研究

作　者: 剧淑君
导　师: 江波
学　校: 江南大学
专　业: 食品科学
关键词: β-D-半乳糖苷酶发酵优化分离纯化酶学性质
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

β-D-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）属于水解酶,催化半乳糖基转移反应生成低聚半乳糖。食品工业中应用该酶催化乳糖转半乳糖苷基水解生产低聚半乳糖的乳制品。β-D-半乳糖苷酶在乳品工业中有着广泛的应用。β-半乳糖苷酶俗称乳糖酶,不仅能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖,而且具有转糖基活性,是一种重要的糖苷水解酶,在食品、药品和分析化学等领域有重要作用。今年来,随着糖生物学的发展,β-半乳糖苷酶逐渐成为乳糖水解和低聚糖合成的重要工具酶,被用于各种糖基化合物。本实验室筛选出一株马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）SK 16.001,利用发酵的方法可以获得较高转苷活力的β-D-半乳糖苷酶,具有工业化应用潜力,有必要对产β-D-半乳糖苷酶的发酵条件进行优化,并对该酶进行纯化,以进一步研究其催化机制及酶反应动力学参数等。利用马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）SK 16.001进行发酵培养生产β-D-半乳糖苷酶时,通过产酶条件的优化,得到最佳培养基组成为,乳糖质量浓度为20g/L、酵母膏质量浓度10g/L、蛋白胨（鱼粉）质量浓度为20g/L、NaH2PO4 0.04%;最佳的培养条件为:培养基初始pH为6.5、培养温度30℃、摇床转速为150r/min。在这个最适培养条件下酶活力可以达到13.24U/mL。发酵得到的β-D-半乳糖苷酶液样品先后经过硫酸铵分级盐析、透析脱盐、DEAE–Sepharose fast flow离子强度梯度层析、Superdex 75 Prep Grade凝胶过滤后,从发酵液中分离纯化马克斯克鲁维酵母β-D-半乳糖苷酶,纯化酶液经SDS-PAGE电泳鉴定得到单一蛋白条带,计算出β-D-半乳糖苷酶的相对分子质量约为63315。随后研究了纯化后β-D-半乳糖苷酶的酶学性质:β-D-半乳糖苷酶最适反应温度和pH分别为35℃和7.0, Mg²⁺、Co²⁺轻微抑制酶活性,Ca²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺对酶活的抑制作用较大,Mn²⁺对酶活有激活作用。然后利用β-D-半乳糖苷酶反应生成低聚半乳糖,其中三糖、四糖得率为13.9%,单糖得率为41.8%。GOS中转移二糖得率为16.2%。总的GOS得率为30.1%。

β-D-半乳糖苷酶的发酵生产、分离纯化和性质研究

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