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产1，3-丙二醇克雷伯氏菌降低2，3-丁二醇合成的基因改造

作　者: 郭欣坤
导　师: 方慧英
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 1,3-丙二醇 2,3-丁二醇基因敲除克雷伯氏菌 Red重组技术
分类号: TQ923
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

1,3-丙二醇是公认的本世纪最有应用前途的三碳化合物之一，而克雷伯氏菌(K.pneumoniae)是众多研究者主要研究的产1,3-丙二醇菌株。克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的同时，会产生大量2,3-丁二醇、乙酸、乳酸、乙醇、琥珀酸等副产物，其中2,3-丁二醇是主要副产物，它的产生不仅消耗了用于产生1,3-丙二醇的碳源和还原力，而且因其与1,3-丙二醇很难分离，大大增加了下游分离提纯的难度。本文通过基因手段调整克雷伯氏菌的代谢途径，降低主要副产物2,3-丁二醇，为1,3-丙二醇产业化菌株的改造提供借鉴。在对克雷伯氏菌代谢分析的基础上，构建2,3-丁二醇合成途径关键酶基因budA和budC基因敲除片段，利用Red重组技术对克雷伯氏菌染色体基因组上budA和budC基因进行敲除。PCR验证表明两个基因缺失菌株的两个目的基因缺失。酶活测定显示K.neumoniae ZG38(budC)2,3-丁二醇脱氢酶酶活下降约60%，K. pneumoniae ZG38(budA)没有检测出α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活，完成了基因缺失菌株K. pneumoniae ZG38(budA)和K. pneumoniae ZG38(budC)的构建。K. pneumoniae ZG38(budA)和K. pneumoniae ZG38(budC)初步发酵实验表明，所获得的两株菌生长性能受到不同程度的影响：budA基因缺失菌株无2,3-丁二醇和1,3-丙二醇的产生，但乳酸、琥珀酸、乙醇和乙酸的产量较出发菌株都有明显增长，而budC基因的缺失使菌株1,3-丙二醇产量提高了10%，2,3-丁二醇降低为原来的71%。通过对K. pneumoniae ZG38(budA)与K. pneumoniae ZG38(budC)的发酵数据分析推测克雷伯氏菌可能存在2,3-丁二醇回补途径，即2,3-丁二醇循环。基于本研究budC基因缺失菌株有机酸过量积累的研究结果，对K. pneumoniaeZG38(budC)发酵采用pH策略优化。pH-start优化结果表明，菌株在初始pH为9时1,3-丙二醇产量最高，达到22.1g/L，产量为出发菌株的109%，2,3-丁二醇产量为3.5g/L，为出发菌株的74%。恒定pH优化结果显示，pH为7时，1,3-丙二醇产量最高，为24.2g/L，提高了15%，2,3-丁二醇产量相对较低，为1.1g/L，为出发菌株的50%。恒定pH策略明显优于pH-start。5L罐恒定pH发酵显示1,3-丙二醇的产量可达为66.9g/L，2,3-丁二醇为6.2g/L，1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的产量为原来的110%和70%。本研究结果为低副产物克雷伯氏菌的改造提供了新依据。

产1，3-丙二醇克雷伯氏菌降低2，3-丁二醇合成的基因改造

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