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那西肽发酵条件优化研究

作　者: 夏俊
导　师: 薛正莲
学　校: 安徽工程大学
专　业: 发酵工程
关键词: 那西肽活跃链霉菌发酵培养条件放大动力学
分类号: TQ465
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

那西肽(nosiheptide)又叫诺西肽,是含硫多肽类兽用抗生素,胞内产物,由活跃链霉菌发酵产生,为一种高效低毒的畜禽专用新型环保绿色抗生素类生长促进剂。目前,那西肽发酵的水平较低,成本高、应用受限制。因此,对那西肽发酵工艺进行深入研究具有重要意义。为了提高那西肽发酵水平,以实验室保藏的36号菌株进行发酵工艺优化,分别对活跃链霉菌斜面培养条件、摇瓶发酵培养条件和培养基以及发酵动力学进行了初步研究。探索活跃链霉菌摇瓶发酵合成那西肽的固体斜面培养条件的最佳工艺。方法是利用单因素与正交试验对固体斜面培养条件进行优化。结果得到合成那西肽的活跃链霉菌的固体斜面最优培养条件为：初始pH为7.8,培养温度为37℃,培养时间为3d,冷藏时间为0-3周,那西肽产量可达936mg/L。与原工艺相比较,那西肽的产量增加了13.8%。研究活跃链霉菌摇瓶发酵合成那西肽的条件。研究结果表明：在实验范围内,种龄、接种量、初始pH、溶氧和温度对那西肽产量、菌体干重、糖利用率、基于菌体干重得率与基于菌体糖耗得率总体表现先增大后减少的趋势。最后,在种龄40h、接种量5%、初始pH6.5、装液量8%、28℃的优化条件下,那西肽产量达到1194mg/L。与原工艺相比较,那西肽的产量增加了29.3%。同时又深入研究了pH对活跃链霉菌产那西肽的影响,结果显示：种子初始pH6.5时,菌体的干重最高,菌体最粗壮。利用均匀试验得到pH控制优化策略为：培养基初始pH5.5、发酵培养基初始pH5.5和发酵过程控制pH为6.8,那西肽产量达1118mg/L,比原工艺提高了6.1%。根据那西肽生物合成组分,考察出前体物对那西肽产量的影响,丝氨酸对那西肽生物合成的促进作用,要优于丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、谷氨酸、半氨酸、丙氨酸和蛋氨酸,为适合的前体；丝氨酸的最佳作用时间和浓度分别为48h与0.3mg/L。在此条件下,那西肽的产量可达1033mg/L,与不添加前体相比提高了17.2%。利用均匀试验,在摇瓶中得到发酵培养基混合碳源配方为：液化淀粉为8%,湖精为1.5%,葡萄糖为2%,那西肽产量达至1451mg/L,比原工艺提高了55%。得到优化方案放大到10L发酵罐上,促进了那西肽菌体的繁殖,提高了菌丝体的浓度和活力,缩短初级代谢时间,相对应延长次级代谢时间,提高了那西肽的得率。利用10L发酵罐,发现活跃链霉菌体生长可以用Logistic方程,那西肽生成可用Luedeking-Piret方程,糖消耗用类似Luedekin-Piret方程描述。该模型能较好地反映那西肽的分批发酵过程。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-15
第1章文献综述  15-25
  1.1 那西肽概述  15-16
  1.2 那西肽分子结构与理化性质概况  16-17
  1.3 那西肽抗菌机制  17
  1.4 那西肽的生物合成途径  17-18
  1.5 那西肽的发酵生产  18-22
    1.5.1 那西肽产生菌的菌种特性  18
    1.5.2 诱变育种  18-19
    1.5.3 那西肽发酵工艺  19-21
    1.5.4 那西肽的提取工艺  21
    1.5.5 那西肽的分析检测方法  21-22
  1.6 微生物发酵工艺的优化策略  22-23
  1.7 本论文研究意义与目标  23-25
第2章那西肽发酵条件的初步研究  25-40
  2.1 实验材料  25-28
    2.1.1 菌株  25
    2.1.2 培养基  25-26
      2.1.2.1 斜面及平板培养基  25-26
      2.1.2.2 种子培养基  26
      2.1.2.3 发酵培养基  26
    2.1.3 主要试剂  26-27
    2.1.4 主要实验设备  27-28
  2.2 分析方法  28-31
    2.2.1 pH测定  28
    2.2.2 那西肽的含量测定  28
    2.2.3 菌丝体干重(DCW)的测定  28
    2.2.4 糖的测定  28-30
    2.2.5 氨基氮测定方法  30-31
  2.3 结果和讨论  31-39
    2.3.1 种子培养时间的初步确定  31-32
    2.3.2 发酵培养时间的确定  32-33
    2.3.3 孢子质量对发酵的影响  33-39
      2.3.3.1 固体斜面冷藏时间对合成那西肽的影响  33-34
      2.3.3.2 固体斜面培养温度对合成那西肽的影响  34-35
      2.3.3.3 固体斜面培养时间对合成那西肽的影响  35
      2.3.3.4 固体斜面初始pH对合成那西肽的影响  35-36
      2.3.3.5 固体斜面培养条件的正交试验  36-38
      2.3.3.6 结果验证  38-39
  2.4 结论  39-40
第3章那西肽发酵条件优化研究  40-63
  3.1 实验材料  40-43
    3.1.1 菌种  40
    3.1.2 培养基  40-41
      3.1.2.1 种子培养基  40-41
      3.1.2.2 摇瓶发酵培养基  41
      3.1.2.3 发酵罐培养基  41
    3.1.3 主要材料质量  41-42
    3.1.4 主要试剂  42
    3.1.5 主要实验设备  42-43
  3.2 试验方法  43-44
    3.2.1 摇瓶发酵实验  43
    3.2.2 发酵罐培养工艺指标  43
    3.2.3 菌丝体干重(DCW)的测定  43-44
    3.2.4 氨基氮测定方法  44
    3.2.5 糖的测定  44
    3.2.6 那西肽产量的测定  44
  3.3 结果和讨论  44-61
    3.3.1 发酵条件优化和放大  44-48
      3.3.1.1 种子质量对那西肽产量的影响  44-46
        3.3.1.1.1 种龄影响  44-45
        3.3.1.1.2 接种量影响  45-46
      3.3.1.2 初始pH值影响  46
      3.3.1.3 不同装液量影响  46-47
      3.3.1.4 温度影响  47-48
    3.3.2 分段控制pH对那西肽产量的影响  48-53
      3.3.2.1 种子培养基不同初始pH对那西肽产量的影响  48-49
      3.3.2.2 pH调控对那西肽产量的影响  49-53
    3.3.3 前体对那西肽产量的影响  53-56
      3.3.3.1 前体种类对那西肽生物合成的影响  53-54
      3.3.3.2 不同丝氨酸添加时间对那西肽生物合成的影响  54-55
      3.3.3.3 不同丝氨酸添加量对那西肽生物合成的影响  55-56
      3.3.3.4 优化前后发酵过程的考察  56
    3.3.4 碳源对那西肽产量的影响  56-61
      3.3.4.1 初始碳源对那西肽产量的影响  56-59
      3.3.4.2 碳源优化结果放大到10L发酵罐  59-61
  3.4 结论  61-63
第4章那西肽发酵动力学初步研究  63-73
  4.1 实验材料  63-64
    4.1.1 菌种  63
    4.1.2 培养基  63-64
      4.1.2.1 种子培养基  63
      4.1.2.2 发酵罐培养基  63-64
    4.1.3 主要材料质量  64
    4.1.4 主要试剂  64
    4.1.5 主要实验设备  64
  4.2 试验方法  64-65
    4.2.1 发酵罐发酵实验  64
    4.2.2 发酵罐培养工艺指标  64
    4.2.3 菌丝体干重(DCW)的测定  64
    4.2.4 氨基氮测定方法  64-65
    4.2.5 糖的测定  65
    4.2.6 那西肽产量的测定  65
  4.3 活跃链霉菌产那西肽发酵特征  65-71
    4.3.1 活跃链霉菌生长动力学  66-68
    4.3.2 那西肽形成动力学  68-69
    4.3.3 底物消耗动力学  69-71
  4.4 模型适用验证  71
  4.5 结论  71-73
第5章结论与展望  73-75
  5.1 结论  73-74
  5.2 展望  74-75
参考文献  75-81
本人在攻读研究生期间发表的学术论文  81-82
致谢  82-83

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