学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
靶向Caspase-3蛋白酶药物体内外筛选及评价体系的建立
作 者: 段相国
导 师: 丁剑冰
学 校: 新疆医科大学
专 业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 细胞凋亡 Caspase-3蛋白酶 荧光素酶 动物模型 药物筛选
分类号: Q789
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
下 载: 12次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
目的:针对目前缺乏合适的可以实时观测细胞凋亡的体内外实验模型,本课题旨在建立一种通过报告基因实时反映体内外肝细胞凋亡的细胞及小鼠模型,该模型的建立将有助于方便研究各种因素造成肝细胞凋亡的机制以及进行抗凋亡药物的体内外评价。方法:第一部分靶向Caspase-3蛋白酶药物筛选及评侩细胞模型的建立采用荧光素酶重组及互补策略,构建能用于指示细胞凋亡的表达载体attB-ANluc(ΔDEVD) BCluc,其具体方法是:用萤火虫荧光素酶(Fluc)作为细胞内凋亡发生的报告基因,把Fluc分成单独没有活性两段N-Fluc和C-Fluc, N-Fluc和C-Fluc的N端分别连接上已知具有高亲和力的A肽和B肽,在N-Fluc和B肽间插入caspase-3的酶切位点DEVD,并在报告基因前插入噬菌体整合酶的识别位点attB。未发生细胞凋亡时,Fluc的两端被隔开,Fluc几乎没有活性;当细胞发生凋亡时激活caspase-3蛋白酶,caspase-3识别其酶切位点DEVD,切开A肽-NFluc与B肽-CFluc之间的连接,由于A肽和B肽具有高亲和力结合的特性,使得Fluc的N段和C段相互靠近而恢复其活性。将已构建载体通过双酶切鉴定及基因测序鉴定后,完全正确的产物大提质粒通过脂质体共转染Hepal-6细胞,阿霉素诱导后,应用活体荧光成像技术监测荧光素酶活性的变化来指示细胞内凋亡的发生,同时应用Western blot检测有活性的Caspase-3蛋白酶的表达,从而建立一种通过监测荧光素酶的活性来反映Caspase-3蛋白酶的活性的可视化的细胞模型。第二部分靶向Caspase-3蛋白酶药物筛查和评价细胞模型的应用1.为了证实所建立的细胞模型能够根据荧光素酶活性变化特异性指示不同浓度药物诱导细胞凋亡的效果,指示载体转染Hepal-6细胞,转染24h后以不同浓度的阿霉素诱导细胞凋亡,48h后收集细胞并用活体荧光成像监测荧光素酶活性变化同时应用Western blot检测Caspase-3蛋白酶的活性变化。2.为了验证所建立的细胞模型是否能够根据荧光素酶活性变化特异性指示不同浓度凋亡抑制剂对药物诱导细胞凋亡的效果做出评价,指示载体质粒与shRNA质粒共转染Hepal-6细胞,转染24h后以一定浓度的阿霉素诱导细胞凋亡,48h后收集细胞并用活体荧光成像监测荧光素酶的活性同时应用Western blot检测Caspase-3蛋白酶的活性。第三部分靶向Caspase-3蛋白酶药物评价和筛查瞬时表达模型的建立及活体荧光成像条件的优化为了建立可视化的小鼠模型,首先要对活体荧光成像的条件进行优化,建立目的基因瞬时表达小鼠模型,既快速又能准确地对Caspase-3蛋白酶药物作出评价和筛查,以及对诱导肝细胞凋亡的药物或病理模型进行评价。通过对表达载体质粒attB-ANluc-DEVD-BCluc应用水动力技术转染至小鼠肝脏,在不同荧光背景下,通过活体荧光成像技术优化最佳成像条件、Western blot监测小鼠肝脏Fluc的表达,建立Caspase-3蛋白酶指示载体瞬时表达小鼠模型。第四部分靶向Caspase-3蛋白酶药物筛选和评价长期稳定表达小鼠模型的建立将含OC31整合酶识别位点attB的Caspase-3蛋白表达载体attB-ANluc-DEVD-BCluc10μg与编码OC31整合酶的质粒Pphic31φ20μg,通过水动力技术共转染至小鼠肝脏,Pphic31φ表达的整合酶识别attB-ANluc-DEVD-BCluc的attB位点,并介导质粒attB-ANluc-DEVD-BCluc与小鼠染色体上attP的同源序列(mp11、mp12)间进行位点特异性整合,将attB-ANluc-DEVD-BCluc整合入小鼠肝细胞染色体,巢式PCR对目的基因是否发生整合以及整合位点做鉴定,通过DNA电泳以及基因测序来佐证;应用活体荧光成像技术监测小鼠体内荧光素酶活性的表达,结合Western blot监测小鼠肝脏Fluc的表达以及Caspase-3蛋白酶活性的变化,建立一种通过可视化手段监测小鼠体内荧光素酶活性来反映Caspase-3蛋白酶活性的长期稳定表达小鼠模型。第五部分靶向Caspase-3蛋白酶药物筛查和评价可视化小鼠模型的应用1.ConA诱导的免疫性肝损伤模型中的应用为了验证所建立的小鼠模型能否根据荧光素酶活性变化特异性指示药物诱导细胞凋亡的效果,小鼠尾静脉注射ConA诱导肝细胞凋亡;通过活体荧光成像监测不同浓度及同一浓度不同时间的ConA诱导肝细胞凋亡的变化,同时应用血清学及组织学评价肝脏的损伤程度。2. LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎模型中的应用为了验证所建立的小鼠模型能否根据荧光素酶活性变化特异性指示药物诱导细胞凋亡的效果,用LPS/D-GALN诱导肝细胞凋亡;通过活体荧光成像监测了不同浓度及同一浓度不同时间的LPS/D-GALN诱导肝细胞凋亡的变化,同时应用血清学及组织学评价肝脏的损伤程度。3.抗调亡药物(shRNA)的体外评价试验(不同浓度梯度)为了验证所建立的小鼠模型是否能够根据荧光素酶活性变化特异性指示凋亡抑制剂(shRNA)对药物诱导细胞凋亡的抑制效果做出评价,我们构建了靶向caspase-3的shRNA,通过水动力转染技术分别将caspase-3干扰RNA及空载对照质粒转染到整合了attB-ANluc-DEVD-BCluc的小鼠模型体内,并给于LPS/D-GALN诱导凋亡,活体荧光成像监测小鼠肝脏中荧光素酶活性变化。4.小鼠模型活体荧光成像评价凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)为了验证所建立的小鼠模型是否能够根据荧光素酶活性变化特异性指示凋亡抑制剂对药物诱导细胞凋亡的抑制效果做出评价,将整合了attB-ANluc-DEVD-BCluc的小鼠模型,给于LPS/D-GALN诱导肝细胞凋亡,2h后尾静脉给予凋亡抑制剂Z-VAD-FMK,9h后活体荧光成像技术监测荧光素酶的活性变化。5.活体荧光成像监测MHV-3诱导的肝细胞凋亡肝脏内发生的炎症及各种因素引起的感染常诱导肝细胞凋亡的发生,为了验证该模型能否用于监测肝脏内炎症及感染状态,用致死剂量的鼠肝炎病毒MHV-3感染整合attB-ANluc-DEVD-BCluc的小鼠模型,并于感染后不同时间点监测荧光素酶活性变化。结果:第一部分在我们建立的细胞体系中经阿霉素处理后24h,细胞出现显著凋亡,阿霉素诱导荧光素酶活性的升高与细胞凋亡相关,并呈现剂量依赖效应,为了证实荧光素酶活性变化特异性依赖于Caspase-3蛋白酶活性对报告基因attB-ANluc (ΔDEVD)BCluc的切割,将上述处理后的细胞进行Western blot检测。结果显示:阿霉素药物诱导组可检测到attB-ANluc (ΔDEVD) BCluc的N端切割条带,而对照组未见attB-ANluc (ΔDEVD) BCluc的切割,并且对attB-ANluc (ΔDEVD) BCluc的切割特异性依赖于有活性的Caspase-3蛋白酶。第二部分细胞模型的应用1.活体荧光成像结果显示,随着药物浓度的升高荧光素酶活性逐渐升高,其特异性依赖于有活性的Caspase-3蛋白酶的变化。2.活体荧光成像结果显示,靶向Caspase-3shRNA在24h后的抑制效果大于48h后的抑制效果,与Western blot所示结果一致。第三部分瞬时表达小鼠模型的建立及活体荧光成像的条件优化1.成功建立了活体荧光成像Caspase-3蛋白酶药物筛查和评价的瞬时表达小鼠模型;2.活体荧光成像的条件优化,优化了活体荧光成像Caspase-3蛋白酶药物筛查和评价的小鼠模型。3.水动力转染后指示载体在小鼠肝脏特异性表达,经LPS/DalN诱导肝细胞凋亡后24h萤光素酶表达达到高峰,随着时间的推移萤光素酶表达逐渐降低,10天左右降至本底;4.应用Western blot对有活性的Caspase-3蛋白酶进行了检测,结果与应用活体荧光成像监测到的萤光素酶活性表达具有正相关性;第四部分长期稳定表达小鼠模型的建立水动力转染后指示载体在小鼠肝脏特异性表达,1d后达到高峰,随后逐渐降低,10天内降至本底。通过巢式PCR对小鼠是否发生整合以及整合位点做进一步鉴定,结果显示,在生成的两个杂合位点attR和attL扩增出了大小约250bp的特异性片段,将PCR产物凝胶回收后连接T载体,进行测序,BLAST比对分析发现,表达载体和小鼠第2号染色体的mpsL1位点发生整合,整合铰链区(core area)为TTG,且有数个碱基的丢失,至此证实成功建立了Caspase-3指示载体长期稳定表达小鼠模型。第五部分可视化长期稳定表达小鼠模型的应用1. ConA诱导的免疫性肝损伤模型中的应用结果显示:所建立的小鼠模型能够通过监测荧光素酶活性的变化来指示不同浓度及同一浓度不同时间的ConA诱导肝细胞凋亡,并且与血清学和组织学所示结果一致。2. LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎模型中的应用结果显示:所建立的小鼠模型能够通过监测荧光素酶活性的变化来指示不同浓度及同一浓度不同时间的LPS/D-GALN所诱导的肝细胞凋亡,并且与血清学和组织学所示结果一致。3.抗调亡药物(shRNA)的体外评价试验(不同浓度梯度)结果证实:所建立的小鼠模型能够通过监测荧光素酶活性的变化来指示抗调亡药物(shRNA)抑制凋亡发生的效果,24h后的抑制效果明显大于48h后的抑制效果。4.小鼠模型活体荧光成像评价凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)结果显示,凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)与对照组相比荧光素酶活性下降了大约150倍左右,说明Z-VAD-FMK抑制了LPS/D-GALN诱导的肝细胞凋亡。5.活体荧光成像监测MHV-3诱导的肝细胞凋亡结果显示,感染后48h荧光素酶活性升高,72h最强,96h小鼠死亡,说明MHV-3感染诱导了肝细胞凋亡的发生,这与文献报道一致,说明该模型能够用于指示肝脏内的炎症及感染。结论:成功建立了一种监测Caspase-3蛋白酶活性的细胞及小鼠模型,通过可视化监测荧光素酶的活性来反应Caspase-3蛋白酶活性的表达水平,从而为抗凋亡药物的体内外筛查、评价以及抗凋亡机制的研究提供了一定的技术平台。
|
全文目录
中英文縮略词对照表 5-10 摘要 10-15 Abstract 15-18 技术流程图 18-19 前言 19-26 第一部分 靶向Caspase-3蛋白酶药物筛选及评价细胞模型的建立 26-41 1. 研究内容与方法 26-36 1.1 研究对象 26-28 1.2 实验方法 28-36 1.3 统计学分析 36 2. 实验结果 36-39 3. 讨论 39-40 4. 小结 40-41 第二部分 靶向Caspase-3蛋白酶药物筛查和评价细胞模型的应用 41-53 1. 实验内容与方法 41-46 1.1 实验对象 41-42 1.2 实验方法 42-46 1.3 统计学分析 46 2. 实验结果 46-50 3. 讨论 50-51 4. 小结 51-53 第三部分 靶向Caspase-3蛋白酶药物评价和筛查瞬时表达模型的建立及活体荧光成像条件的优化 53-62 1. 实验材料与方法 53-57 1.1 实验材料 53-54 1.2 实验方法 54-57 1.3 统计方法 57 2. 实验结果 57-60 3. 讨论 60-61 4. 小结 61-62 第四部分 靶向Caspase-3蛋白酶药物筛选和评价长期稳定表达小鼠模型的建立 62-72 1. 实验材料与方法 63-67 1.1 实验材料 63 1.2 实验方法 63-67 1.3 统计方法 67 2. 实验结果 67-70 3. 讨论 70-71 4. 小结 71-72 第五部分 靶向Caspase-3蛋白酶药物筛查和评价长期稳定模型的应用 72-88 实验一 ConA诱导的免疫性肝损伤模型中的应用 72-77 1. 验材料与方法 72-74 1.1 实验材料 72-73 1.2 实验方法 73 1.3 统计方法 73-74 2. 实验结果 74-76 3. 小结 76-77 实验二 LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎模型中的应用 77-82 1. 实验材料与方法 77-78 1.1 实验材料 77 1.2 实验方法 77-78 1.3 统计方法 78 2. 实验结果 78-81 3. 小结 81-82 实验三 凋亡抑制剂在小动物模型中的评价 82-88 1. 验材料与方法 82-83 1.1 实验材料 82 1.2 实验方法 82-83 1.3 统计方法 83 2. 实验结果 83-85 3. 小结 85-86 4. 讨论 86-88 总结 88-91 致谢 91-92 参考文献 92-110 综述 110-116 参考文献 114-116 攻读博士学位期间发表的相关学术论文 116-118 个人简历 118-119 导师评阅表 119
|
相似论文
- 西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究,S968.3
- CADPE抗肿瘤作用及对胃癌细胞凋亡的影响,R735.2
- 醋酸铅对鲤鱼卵巢上皮细胞毒性的研究,X174
- 地克珠利对柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子甘油醛-3-磷酸脱氢酶的影响,S858.31
- PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞钙信号的影响及其机理初探,S858.28
- β-catenin在猪卵巢组织中的表达以及对猪卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇生成酶的影响,S828
- 伏马菌素B1和黄曲霉毒素B1联合诱导Vero细胞凋亡的研究,S856.9
- 黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导锦鲤原代肝细胞凋亡机制的初步研究,S856.9
- 沉默BMPR-IB基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡及BMP通路相关基因表达的影响,S828
- 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对鸡软骨细胞增殖、分化及凋亡的影响,S858.31
- Foxol对小鼠颗粒细胞凋亡的影响,S865.13
- 高频电磁场治疗兔内置入物感染的实验研究,R687.3
- 18氟—氟代脱氧葡萄糖诱导Eca-109食管癌细胞凋亡的初步研究,R735.1
- 棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A17v2启动子活性分析,S435.622
- 脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导仓鼠肾细胞凋亡信号转导机制的研究,S856.9
- 维甲酸诱导腭裂小鼠出生前后Wnt通路相关信号分子的表达,R782.21
- 磷脂酶C和D在木聚糖酶诱导的水稻悬浮细胞抗病反应中的作用,S511
- 420nm强脉冲光对痤疮动物模型影响的实验研究,R758.733
- ATP生物发光法检测食品细菌总数试剂盒的研究,TS207.4
- 右旋柠烯通过线粒体途径诱导人白血病细胞凋亡,R733.7
- 商陆皂苷甲对BXSB小鼠肾组织PCNA、Caspase-3、Fas和FasL表达的影响,R285.5
中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程) > 基因工程的应用
© 2012 www.xueweilunwen.com
|