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三种生物的GABA受体基因亚克隆与表达的初步研究

作　者: 杜洁
导　师: 任天瑞
学　校: 上海师范大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 脊椎动物非脊椎动物 GABA受体 RDL 亚克隆原核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

A型γ-氨基丁酸（aminobutyric acid，GABA）受体是一类配体门控离子通道型受体，是脊椎动物和非脊椎动物的中枢神经系统内最主要的抑制性神经递质GABA的受体，由其同源或异源五聚体构成的离子通道上存在许多药物的作用靶点，因此该受体也是医药和农药工作者研究的重点。但是天然的受体在个体上的数量比较少，亚克隆表达有利于大量获得有活性的受体，对于开发新的，高效的，安全的农药具有重要的指导意义。本文通过分子亚克隆技术尝试对脊椎动物和昆虫的GABA受体及其突变抗狄氏剂的受体（RDL）的克隆及异源表达做了部分研究。本实验采用分子生物学实验方法研究果蝇GABA受体的整体及部分结构的信息。从NCBI库上搜到的果蝇的RDL全序列分为全长，和截去部分N端胞外区进行构建，分别与表达载体pET21a融合，结果是在37℃IPTG0.5mM诱导3h条件下E.coli BL21（DE3）细胞里诱导表达，全长含有HisTag的蛋白有表达，而截去部分未表达即使换表达菌株也无表达。通过SDS-PAGE电泳图谱检测，后通过western blot检测表达蛋白的特异性结果正确但纯度及量都不够。本文是首次用原核体系尝试表达真核动物的GABA受体全长（RDL）。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章文献综述  9-29
  1.1 GABA 及其受体的概述  9-13
    1.1.1 哺乳动物 GABA 受体  9-12
    1.1.2 昆虫 GABA 受体  12-13
  1.2 果蝇 GABA 受体亚基的分子生物学  13-18
    1.2.1 Rdl 编码的亚基与昆虫 GABA 受体的特征药理学  14-15
    1.2.2 Rdl 基因的可变剪接  15
    1.2.3 RDL 作为天然昆虫 GABA 受体的模型  15-18
  1.3 GABAA 受体相关农药研究进展  18
  1.4 不同的表达体系  18-27
    1.4.1 原核体系  19-22
    1.4.2 酵母表达系统  22-24
    1.4.3 昆虫细胞表达系统  24-25
    1.4.4 哺乳动物细胞表达系统  25-26
    1.4.5 总结  26-27
  1.5 本论文研究内容目的及意义  27-29
    1.5.1 本论文的研究目的及意义  27
    1.5.2 研究内容  27-29
第二章果蝇 GABA 受体 RDL 全长，截去部分胞外区的表达及鉴定  29-65
  2.1 实验材料及设备  29-32
    2.1.1 质粒和菌株  29-30
    2.1.2. 工具酶及主要的试剂  30-31
    2.1.3 其他试剂及配制  31-32
    2.1.4 实验仪器及设备  32
  2.2 载体构建示意图  32-34
  2.3 实验方法  34-42
    2.3.1 DH5 感受态的制备  34
    2.3.2 质粒的小量抽提  34-35
    2.3.3 重组质粒的双酶切鉴定  35-36
    2.3.4 重组质粒的测序鉴定  36
    2.3.5 BL21（DE3）感受态的制备  36
    2.3.6 转化  36
    2.3.7 单酶切  36
    2.3.8 重组蛋白的诱导表达  36-37
    2.3.9 SDS-PAGE 鉴定  37-38
    2.3.10 目的蛋白的获得（收集包涵体和上清）  38
    2.3.11 镍柱纯化蛋白（上清和沉淀）  38-39
    2.3.12 分离的蛋白的鉴定（SDS-PAGE 胶）  39
    2.3.13 镍柱的复性  39-40
    2.3.14 蛋白的纯化（去盐）  40
    2.3.15 western blot 鉴定  40-41
    2.3.16 Brandford 法测定重组蛋白浓度  41-42
  2.4 结果与讨论  42-61
    2.4.1 RDL 合成序列及测序  42-51
    2.4.2 抽质粒及其单，双酶切鉴定  51
    2.4.3 全长重组质粒的测序结果  51-54
    2.4.4 全长重组质粒的单，双酶切鉴定  54-55
    2.4.5 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达  55-56
    2.4.6 重组蛋白最佳诱导时间的确定  56-58
    2.4.7 重组蛋白表达方式的判定  58
    2.4.8 果蝇 RDL 全长蛋白的纯化  58-59
    2.4.9 western blot 鉴定  59-60
    2.4.10 蛋白浓度的测定  60-61
  2.5 讨论  61-65
第三章鳙鱼的 GABA 受体及二化螟的亚克隆  65-85
  3.1 鳙鱼的亚克隆  65-70
    3.1.1 实验材料  65-66
    3.1.2 实验方法  66-70
  3.2 二化螟的亚克隆  70-77
    3.2.1 实验材料  70-71
    3.2.2 实验方法  71-77
  3.3 结果与分析  77-82
    3.3.1 鳙鱼总 RNA 抽提的结果  77-78
    3.3.2 鳙鱼 GABAA 受体 3 的 RT—PCR 结果  78
    3.3.3 二化螟总 RNA 抽提的结果  78-79
    3.3.4 二化螟 RDL 亚基的 RT-PCR 结果  79
    3.3.5 抽质粒及双酶切结果  79-80
    3.3.6 测序结果  80-82
  3.4 讨论  82-85
第四章工作总结及展望  85-86
  4.1 总结  85
  4.2 工作展望  85-86
致谢  86-87
参考文献  87-97
作者简介  97

三种生物的GABA受体基因亚克隆与表达的初步研究

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