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融合表达载体的构建和应用以及双酶偶联催化合成N-乙酰-D-神经氨酸

作　者: 张飞飞
导　师: 尚广东
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物技术
关键词: 双标签融合表达载体融合蛋白亲和纯化 TEV蛋白酶 N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶 N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶 N-乙酰-D-神经氨酸全细胞催化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

许多外源蛋白在大肠杆菌内表达是以不可溶、无生物学活性的包涵体形式存在,这就为蛋白质功能的研究带来困难。目的蛋白的融合表达是提高蛋白可溶性的有效方案之一。为构建通用型融合表达载体,本研究将五种常见的融合标签即突变型麦芽糖结合蛋白(mMBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、细菌翻译起始因子(IF2)、氮源利用物质A(NusA)以及谷胱甘肽转移酶(GST)；另外还选择了三种伴侣蛋白GroEL、DnaK、TF分别克隆至原核表达载体pET30a(+)获得了双标签融合表达载体。这些表达载体含有相同的克隆位点,填充片段以及位于融合标签羧基端的烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的酶切位点。四个N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因克隆到mMBP双标签融合表达载体后,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明这些融合蛋白均得到了高效表达且几乎完全可溶,而在非融合状态下四个基因均以不可溶的形式存在。融合蛋白可通过Ni-NTA亲和层析来纯化,再以TEV酶切去除融合标签。mMBP和GST融合的蛋白可采用亲和树脂和Ni-NTA亲和层析相结合的方式来纯化目的蛋白。TEV酶切四个融合蛋白均获得了预期的带型。新型的原核融合表达载体为蛋白的融合表达、分离纯化及功能研究提供了更多的选择。N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)以及其衍生物是非常重要的生物分子,因为这些糖分子往往处于大分子物质的末端并且参与了许多生理和病理过程。而且Neu5Ac还是合成抗流感病毒药物扎那米韦的中间体,这就使得Neu5Ac的用量大大增加。酶法催化成合成Neu5Ac的方法因其具有操作简单,成本低,环保等优点而广受欢迎。首先由N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶将N-乙酰-D-葡萄糖胺异构化为N-乙酰-D-甘露糖胺,然后由Neu5Ac醛缩酶催化后者与丙酮酸之间的缩合而得到Neu5Ac。本研究通过将文献已经报道过的异构酶进行融合表达来增大其可溶性,从而可能提高活性。另外通过与猪源肾素结合蛋白(pRnBP)同源性搜索,从多拟形杆菌中扩增出BT0453基因并在大肠杆菌中进行克隆、表达、纯化。将这一系列异构酶与来源于大肠杆菌中的醛缩酶进行偶联催化,从中筛选出活性较高的异构酶。结果表明BT0453蛋白的活性最高,很有可能是由于BT0453蛋白的可溶性较高,几乎占总蛋白的80%。100ml全细胞水平的反应体系中,反应12h后转化率达到45.6%,获得112.8g.1-1的Neu5Ac。另外尝试反应过程中添加丙酮酸钠,反应12h后最终的转化率高达55.8%,这比现有文献报道的数据高出将近20%,这为工业化生产Neu5Ac奠定了基础。

全文目录

名词缩写  3-5
摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-12
第一章综述  12-17
  1.1 融合表达载体的构建和应用  12-13
  1.2 N-乙酰-D-神经氨酸的酶法合成  13-17
第二章融合表达载体的构建和应用  17-30
  2.1 实验材料  17-20
    2.1.1 菌株与质粒  17
    2.1.2 培养基  17
    2.1.3 主要试剂及溶液  17-18
    2.1.4 主要仪器设备  18-19
    2.1.5 引物表和质粒表  19-20
  2.2 实验方法  20-25
    2.2.1 PCR扩增目的基因  20-21
    2.2.2 DNA片段的回收  21
    2.2.3 E. coli DH10B感受态细胞的制备  21
    2.2.4 DNA转化  21-22
    2.2.5 重组质粒的提取和酶切鉴定  22
    2.2.6 制备蛋白胶及SDS-PAGE  22-23
    2.2.7 系列融合表达载体的构建  23-24
    2.2.8 异源基因的克隆和融合表达  24-25
    2.2.9 融合蛋白的纯化和酶切  25
    2.2.10 融合蛋白的TEV酶切  25
  2.3 实验结果  25-29
    2.3.1 双标签融合表达载体的构建  25-26
    2.3.2 TEV蛋白的表达和纯化  26-27
    2.3.3 mMBP融合蛋白的表达,分离纯化和TEV酶切  27-29
  2.4 讨论  29-30
第三章双酶偶联催化合成N-乙酰-D-神经氨酸  30-54
  第一节 N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶的筛选  30-36
    3.1 实验材料  30-31
      3.1.1 蛋白表达菌株  30-31
      3.1.2 主要试剂的配置  31
    3.2 实验方法  31-32
      3.2.1 TBA法测定神经氨酸含量  31-32
      3.2.2 异构酶全细胞酶液的准备  32
      3.2.3 异构酶活性的测定  32
    3.3 实验结果  32-35
      3.3.1 TBA法测定神经氨酸含量标准曲线的建立  32-33
      3.3.2 十种异构酶活性的比较  33-34
      3.3.3 PCC7120和BT0453酶活的比较  34-35
        3.3.3.1 Mg~(2+)浓度  34
        3.3.3.2 ATP浓度  34-35
    3.4 讨论  35-36
  第二节 BT0453和NanA的双酶偶联催化  36-47
    3.5 实验材料  36
      3.5.1 主要试剂的配置  36
      3.5.2 主要仪器设备  36
    3.6 实验方法  36-37
      3.6.1 测定神经氨酸含量的方法  36-37
        3.6.1.1 TBA法  36
        3.6.1.2 HPLC  36-37
          3.6.1.2.1 色谱条件  36-37
      3.6.2 BT0453和NanA双酶偶联催化合成Neu5Ac  37
        3.6.2.1 全细胞酶液的准备  37
        3.6.2.2 双酶偶联催化体系  37
    3.7 实验结果  37-46
      3.7.1 HPLC测定各物质摩尔量标准曲线的建立  37-40
      3.7.2 蛋白浓度标曲的建立  40
      3.7.3 BT0453和NanA双酶偶联催化合成Neu5Ac  40-46
        3.7.3.1 1ml双酶偶联反应体系  40-42
          3.7.3.1.1 异构酶和醛缩酶的酶活单位比例  40-41
          3.7.3.1.2 酶活单位  41
          3.7.3.1.3 ATP浓度  41-42
        3.7.3.2 10ml双酶偶联反应体系  42-43
          3.7.3.2.1 Mg~(2+)浓度  42-43
        3.7.3.3 100ml双酶偶联反应体系  43-46
          3.7.3.3.1 酶活比例  43-44
          3.7.3.3.2 补料处理  44-46
    3.8 讨论  46-47
  第三节 PCC7120的点突变  47-54
    3.9 实验材料  47-48
      3.9.1 引物表和质粒表  47-48
    3.10 实验方法  48-49
      3.10.1 系列点突变载体的构建  48-49
      3.10.2 突变的PCC7120异构酶全细胞酶液的准备  49
    3.11 实验结果  49-53
      3.11.1 不同目的基因点突变的扩增  49-50
      3.11.2 重组质粒的酶切鉴定  50
      3.11.3 突变后的PCC7120的诱导表达  50-52
      3.11.4 突变后的PCC7120酶活的比较  52-53
    3.12 讨论  53-54
参考文献  54-58
在读期间发表的学术论文及研究成果  58-59
致谢  59

融合表达载体的构建和应用以及双酶偶联催化合成N-乙酰-D-神经氨酸

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