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红树林生境新型酯酶的基因克隆、酶学性质研究及红树林水体宏转录组文库的构建

作　者: 李长杰
导　师: 李刚
学　校: 中山大学
专　业: 微生物学
关键词: 宏基因组 宏转录组 红树林 酯酶 酶学特性
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


酯酶（Esterase，EC3.1.1.1），又称羧酸酯酶，可以将甘油三酯分解成脂肪酸和甘油，是重要的工业酶。酯酶因其广泛的底物特异性、异构体选择性、催化活性高、副反应少等特点被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域，并且在生物转化方面具有广阔的应用前景。自然环境中99%以上的微生物在目前的实验条件下不可培养，限制了对微生物资源的利用。宏基因组学和宏转录组学技术提供了解决不可培养问题的一个有效途径，通过直接提取样品总DNA或RNA，然后进行序列分析和功能筛选，省去纯培养过程，扩大了功能基因的来源。在本研究中，首先成功构建了高质量的红树林土壤宏基因组文库。通过功能筛选，获得了2个酯酶基因（estl和estz）阳性克隆。pBLAST比对分析结果表明， estl基因长度为1332bp，编码443个氨基酸，蛋白分子量约为48kDa，与Caulobacter sp.K31（YP001682220）和Spirosoma linguale DSM74（YP003388323）来源的β-lactamase（β-内酰胺酶）分别有46%和38%同源性。此外，序列含有SMTK保守催化序列，属于酯酶家族VIII；estz基因长度为1407bp，编码468个氨基酸，蛋白分子量约为51kDa，与Legionella pneumophila str. Paris（YP123889）和Shewanellapealeana ATCC700345（YP001500179）来源的phospholipase（磷脂酶）分别有54%和42%同源性，属于磷脂酶亚家族。然后estl和estz被成功克隆到pET32a（+）表达载体上，并在Escherichia coli BL21（DE3）中进行了过量表达。重组酶的酶学性质研究结果显示，Estl和Estz最适反应温度和pH分别为51.7℃、pH8.2和40.8℃、pH7.8。表面活性剂Tween-20、Tween-80和TritonX-100无论是低浓度（0.1%）还是高浓度（10%），都对Estl和Estz的活性具有严重抑制作用。令人感兴趣地是，Estz具有很强的耐有机溶剂和耐盐的特性，在30%DMSO和30%乙醇中分别放置50min,仍具有80%和110%的初始酶活力；在4M NaCl溶液中放置1h，可保留80%活性。而Estl则表现出较强的金属离子耐受性，在25mM金属离子溶液中放置50min， Mg2+和Mn2+仅仅使得Estl酶活力分别降至初始酶活力的80%和90%，而Ca2+则促使酶活力提高至初始酶活力的110%。Estz和Estl所具有的独特的酶学性质，使其具有较高的研究价值和工业应用潜力。此外，为了从红树林生境未培养微生物中获得真核功能基因，我们还成功构建了红树林水体的宏转录组文库。文库的库容量为3000个克隆子。电泳分析结果显示，文库重组率约为95%，插入片段分布在0.55kb之间，平均长度约为0.9kb，表明该水体宏转录组文库的质量较好。采用功能法分别从文库中筛选了酯酶和β-葡萄糖苷酶，然而未能筛选到目标基因，可能与文库的库容量较小有关。今后需要构建更多的、具有更大库容量的宏转录组文库或者改变构建文库的宿主菌以及采用基于序列筛选的策略开展宏转录组的研究。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章 前言  10-29
  1.1 酯酶的简介  10-15
  1.2 宏基因组学简介  15-25
  1.4 红树林研究概况  25-26
  1.5 本研究的目的和意义  26-28
  1.6 本论文的主要研究内容  28-29
第二章 红树林土壤宏基因组文库构建及新型酯酶基因的筛选  29-43
  引言  29
  2.1 实验材料  29-32
  2.2 实验方法  32-36
  2.3 实验结果和分析  36-41
  2.4 讨论  41-43
第三章 酯酶基因的原核表达﹑表达条件优化及其酶学性质研究  43-63
  引言  43
  3.1 实验材料  43-46
  3.2 实验方法  46-52
  3.3 实验结果和分析  52-61
  3.4 讨论  61-63
第四章 红树林水体宏转录组文库构建及基因的筛选  63-71
  引言  63
  4.1 实验材料和方法  63-67
  4.2 实验结果  67-69
  4.3 讨论  69-71
总结与展望  71-73
  1.总结  71-72
  2.展望  72-73
参考文献  73-84
缩略词  84-85
硕士期间发表的论文  85-86
致谢  86

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶
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