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番茄Sly-miR166及其靶标基因SlREV的克隆、鉴定及其对果实形成的研究

作　者: 胡国建
导　师: 李正国
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: microRNA HD-ZIPⅢ 花柄离层区果实形成番茄
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

microRNA（miRNA）是一类长度约20~24个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过在转录后水平上下调或抑制靶标基因表达，从而对生物体的生长发育进行精确调控。植物miRNA在营养生长和生殖生长过程中都扮演十分重要的调控作用。miR166作为一种保守性植物miRNA，也广泛的参与了根尖的发育、茎的生长、叶片极性发育、花分生组织发育等过程，然而它对果实形成的调控机制尚不清楚。由于拟南芥属于荚果类，缺乏肉质类果实形成、发育和成熟的典型特征，所以本研究以番茄作为模式植物，研究Sly-miR166及其靶标基因对花的发育和果实形成的影响，这对深入揭示花器官形态建成及果实座果、生长发育的分子机制具有重要意义。本论文取得的主要研究结果如下：1.通过生物信息学分析发现，Sly-miR166在番茄基因组中存在9个基因座。本研究克隆了Sly-pre-miR166b，并对其进行了深入研究。通过5′RACE验证，Sly-miR166可对6个HD-ZIP III家族靶标基因Solyc11g069470、Solyc08g066500、Solyc12g044410、Solyc03g120910、Solyc02g024070和Solyc02g069830的转录本进行保守性剪切降解。2. Sly-miR166及其靶标基因的表达模式分析发现，Sly-miR166主要在根、叶、花和果实中表达。所有靶标基因在根和茎中的表达最高，其次是在叶、花和幼果中，而在成熟果实中几乎检测不到靶标基因的表达。靶标基因在茎、叶和成熟果实中的转录水平与Sly-miR166存在互补的关系，表明Sly-miR166可能通过直接调控靶标基因在茎、叶和果实中的表达发挥重要功能。3.在番茄果实中特异性超表达前体Sly-pre-miR166b引起心皮发育模式改变，致使果实持续内生和部分发生单性结实现象；定量分析结果显示，成熟Sly-miR166表达水平上升，引起所有靶基因下调，进而抑制了TAG1的表达，使花发育的确定性丧失，从而出现果中果的现象。进一步分析发现该家族基因也调节生长素响应基因和胚珠发育基因的表达。4.通过农杆菌介导法，在番茄中超表达野生型靶标基因SlREV和其剪切抑制形式SlREVRis，对比分析发现超表达SlREVRis引起叶片极性改变、茎段维管束结构变化、花柄离层区异位花组织产生、异位心皮的发育和果实融合等表型，表明SlREV可能是多效性基因；而单独超表达SlREV却无明显表型，表明SlREV在茎、花、果实中的功能主要依赖于Sly-miR166在其转录后水平上的调控。5.根据35S::SlREVRis对花柄离层区的重要影响，定量分析表明SlREV通过调控BLIND、GOLET、LeWUS等基因，调控分生细胞的增殖、侧生分生组织和器官边界的形成。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
1 绪论  10-24
  1.1 问题的提出及研究意义  10-11
    1.1.1 问题的提出  10-11
    1.2.2 研究的意义  11
  1.2 植物花器官建成及发育的研究进展  11-18
    1.2.1 花器官的形成  11-13
    1.2.2 控制花分生组织的特化与决定的研究进展  13-16
    1.2.3 心皮发育的研究进展  16-18
  1.3 植物 microRNA 的研究进展  18-20
    1.3.1 植物 microRNA 的合成与作用机理  18-19
    1.3.2 植物 microRNA 的作用  19-20
  1.4 HD-ZIP 家族研究进展  20-21
  1.5 本文研究的目的和研究内容  21-24
    1.5.1 本文研究的目的  21
    1.5.2 本文研究的主要内容  21-22
    1.5.3 全文总体技术路线  22-24
2 番茄 Sly-miR166 前体序列及靶基因的克隆和表达分析  24-52
  2.1 引言  24
  2.2 材料、仪器与方法  24-38
    2.2.1 材料与仪器  24-29
    2.2.2 实验方法  29-38
  2.3 实验结果与分析  38-49
    2.3.1 Sly-miR166 前体序列的预测  38-40
    2.3.2 Sly-miR166b 前体序列的克隆和超表达载体的构建  40-42
    2.3.3 Sly-miR166 对靶基因的剪切鉴定  42-43
    2.3.4 靶标基因 SlREV 的克隆、植物表达载体构建  43-47
    2.3.5 番茄 Sly-miR166 和靶标基因的表达模式分析  47-49
  2.4 讨论  49-50
  2.5 本章小结  50-52
3 Sly-miR166b 及靶基因 SlREV 对番茄生长的影响  52-76
  3.1 引言  52
  3.2 材料、仪器与方法  52-58
    3.2.1 材料与仪器  52-55
    3.2.2 实验方法  55-58
  3.3 实验结果与分析  58-74
    3.3.1 转基因株系的鉴定  58-59
    3.3.2 转基因株系的分析与鉴定  59-66
    3.3.3 各转基因株系的定性分析  66-74
  3.4 讨论  74-75
  3.5 本章小结  75-76
4 结论与展望  76-78
  4.1 主要结论  76
  4.2 本研究的创新点  76-77
  4.3 后续工作展望  77-78
致谢  78-80
参考文献  80-88
附录  88
  A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文  88
  B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目  88

番茄Sly-miR166及其靶标基因SlREV的克隆、鉴定及其对果实形成的研究

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