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CyclinD1通过激活NDR调控细胞周期的机制研究

作　者: 杜朝阳
导　师: 叶昕
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 细胞周期 G1/S进程 cyclinD1/Cdk4 NDR1/2
分类号: Q25
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


Cyclin/Cdk蛋白激酶作为细胞周期调控最为关键的分子在细胞周期调控中发挥重要的作用。不同类型的cyclin/Cdk调控着细胞周期的不同的时期。其中cyclinDl/Cdk4主要在G1期发挥作用。为了进一步研究cyclinDl/Cdk4在细胞周期G1期的功能,我们通过TAP亲和纯化筛选到新的cyclinDl/Cdk4相互作用蛋白NDR1/2。通过GST pu11down和免疫共沉淀实验,我们证实了cyclinD1/Cdk4与NDR1/2在体内外的相互作用。但是,我们并没有发现NDR1/2可以被cyclinD1/Cdk4磷酸化,或者cyclinD1/Cdk4可以被NDR1/2磷酸化。我们也没有发现NDR1/2影响cyclinD1/Cdk4在体外激酶实验中的活性。然而,我们发现cyclinD1可以直接和NDR1/2相互作用,这种相互作用是不依赖于Cdk4的。我们还发现cyclinD1可以上调NDR1/2的活性,而Cdk4没有这种功能。我们还验证了cyclinD1上调NDR的活性是通过释放NDR的自身抑制序列来实现的,与MOB1A和MSTl无关。为了研究cyclinD1是否可以通过上调NDR1/2的活性来调控细胞周期的进程,我们制备了可诱导表达cyclinD1和cyclinD1K112E的稳定细胞株。通过流式细胞术实验我们发现,不仅cyclinD1可以促进细胞周期G1/S期的进程,而且cyclinD1K112E也可以。这就证明cyclinD1可以通过不依赖于Cdk4的信号通路来调控细胞周期。而且我们还发现在正常细胞中过表达cyclinD1或cyclinD1K112E都可以促进细胞周期G1/S期的转换。为了进一步研究cyclinD1的这种功能是否与NDR1/2有关,我们先用siRNA敲低NDR1/2,再用流式细胞术来分析过表达cyclinD1对细胞周期的影响。我们发现敲低NDR1/2后,过表达cyclinD1K112E对细胞周期的促进作用几乎消失。这就证明了cyclinD1可以通过调控NDR1/2的来调控细胞周期。由于NDR调控细胞周期是通过下调p21来起作用的,于是我们在稳定细胞系中敲低p21后,流失细胞术分析发现cyclinD1K112E不再促进S期的进程。鉴于cyclinD1是通过释放NDR的自身抑制序列来调控NDR活性的,我们在稳定细胞系中转染了NDR-IM,流式细胞术分析发现,过表达NDR-IM也可以抑制cyclinD1K112E的对细胞周期的促进作用。我们进一步通过western blot验证了过表达cyclinD1和cyclinD1K112E后NDR的自身磷酸化增强,而相应的p21的蛋白水平下降。而敲低了NDR1/2后,cyclinD1K112E对p21的下调功能几乎消失。这就证明了cyclinD1不仅可以通过Cdk4还可以通过NDR-p21这条通路调控细胞周期的进程。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-9
缩略语表  9-10
引言  10-11
第一章 文献综述  11-24
  第一节 细胞周期概述  11-20
    1. 细胞周期  11
    2. 细胞周期调控  11-20
      2.1 细胞周期蛋白  12-18
        2.1.1 cyclin D  14-17
        2.1.3 cyclin A  17
        2.1.4 cyclin B  17-18
      2.2 细胞周期蛋白依赖性激酶-Cdks  18-19
      2.3 细胞周期抑制因子CKIs  19-20
  第二节 NDR激酶家族与细胞周期调控  20-23
    1. NDR活性的调控  21-22
    2. NDR在细胞中的功能  22-23
  第三节 本文的研究意义  23-24
第二章 材料方法  24-34
  第一节 实验材料  24-26
    1.1 菌种、细胞株、质粒  24
    1.2 抗体及主要试剂  24-25
    1.3 NDRl 和 NDR2 siRNA  25
    1.4 仪器设备  25-26
  第二节 研究方法  26-34
    2.1 相关质粒的构建  26
    2.2 TAP样品的处理  26-27
    2.3 PEI转染细胞  27
    2.4 GST融合蛋白的原核表达和纯化  27-28
    2.5 蛋白浓度的测定  28
    2.6 NDR磷酸化抗体的制备  28
    2.7 ELISA  28-29
    2.8 抗体纯化  29
    2.9 SDS-PAGE  29-30
    2.10 Western Blot  30
    2.11 GST-pulldown  30-31
    2.12 免疫共沉淀  31
    2.13 体外激酶实验  31
    2.14 可诱导稳定表达细胞株的构建  31-32
    2.15 细胞同步化  32
    2.16 细胞PI染色和流式分析  32
    2.17 lipofectamine 2000转染siRNA  32-34
第三章 实验结果  34-59
  第一节 cyclinD1/Cdk4与NDR1/2相互作用的验证  34-38
    1.1 TAP筛选Cdk4新的相互作用蛋白  34-36
    1.2 CyclinD1/Cdk4和NDR1/2体内外相互作用的验证  36-38
  第二节 cyclinD1与NDR1/2相互作用不依赖于Cdk4  38-41
  第三节 CyclinD1/Cdk4与NDR1/2相互不能磷酸化  41-44
  第四节 Cyclin D1上调NDR1/2的活性  44-47
  第五节 cyclinD1通过释放NDR1/2的自身抑制序列来调控NDR活性  47-50
  第六节 cyclinD1可以通过上调NDR活性来促进细胞周期  50-59
第四章 讨论  59-61
第五章 总结  61-62
参考文献  62-73
发表文章  73-74
致谢  74

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学 > 细胞生理学
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