学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

卵转铁蛋白的分离纯化、结构表征及体外抗菌研究

作　者: 袁小军
导　师: 马美湖
学　校: 华中农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 鸡蛋 蛋白质 卵转铁蛋白 纯化 抗菌活性
分类号: R151
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 73次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


卵转铁蛋白具有重要的生物活性功能,比如铁传递、抗菌性、及抑制游离基的形成等。鸡蛋清中卵转铁蛋白的含量比较丰富(12%),但关于蛋清中卵转铁蛋白分离纯化的研究进展却相对较为缓慢。本文采用超滤和离子交换层析两种方法分别对鸡蛋清中的卵转铁蛋白进行分离纯化,分离纯化卵转铁蛋白的过程中分别研究了不同因素对纯化效果的影响,并进行优化；然后研究了分离纯化得到卵转铁蛋白的理化性质及结构表征；研究了卵转铁蛋白体外抗菌活性。主要研究结果如下：1.采用超滤法分离纯化卵转铁蛋白,研究了前处理对降低蛋清液黏度的影响,发现稀释倍数为15倍、剪切速率为7 kr/min、温度为45℃时蛋清液黏度适宜。同时,对超滤过程中的工艺条件进行研究,其中物料的稀释倍数15倍、搅拌速率125r/min、操作压力0.15 MPa及pH值为7。在单因素的基础上,选取操作压力、稀释倍数、搅拌速率三个因素进行正交试验,对超滤过程中的最佳工艺条件进行优化,优化得到的最优组合为A3B2C2,由于最优组合不在正交表组合内,通过验证试验比较最优组合A3B2C2和L9(34)表内最优组合A3B2C1,确定最优组合为A3B2C2,即操作压力为0.15 MPa,稀释倍数为10倍,搅拌速率为125 r/min。最后通过SDS-PAGE凝胶电泳和HPLC对分离得到的卵转铁蛋白进行了鉴定及纯度分析,证实分离得到的蛋白质为卵转铁蛋白,纯度为29.6%。2.在两步层析法分离纯化蛋清中卵转铁蛋白时,卵转铁蛋白先分别用40%饱和度和80%饱和度的硫酸铵进行分级盐析,然后用Q-Sepharose Fast Flow离子交换树脂进行两步层析,第一步层析除掉大部分溶菌酶和抗生物素蛋白,第二步层析用pH8.50.08 mol/L NaC1进行洗脱,通过SDS-PAGE电泳进行鉴定,确定了收集到的洗脱峰3为卵转铁蛋白。通过HPLC得知分离得到的卵转铁蛋白的纯度为98.3%。3.研究了卵转铁蛋白铁离子的结合能力,及各种因素对铁离子结合能力的影响。在pH 5-9的Tris-H3BO4缓冲液中,发现在中性和偏碱性的条件下,卵转铁蛋白的铁结合能力比较高；加入浓度分别为0,40,80,120,160 mmol/L的碳酸氢钠后发现120mmol/L的HCO3-浓度对铁离子的结合较为有效；将卵转铁蛋白置于55℃、60℃、65℃下分别保温30 min,70℃下毛细管保温20s,快速冷却到25℃,测定铁结合能力,研究发现60℃下低温杀菌能保持卵转铁蛋白的铁结合能力；通过圆二色谱分析发现不同铁饱和度卵转铁蛋白随着铁饱和度的增加,α-螺旋有所升高,p-折叠相应的减小,p-转角稍有增加,无规卷曲减少,可能是由于随着铁饱和度的增加,卵转铁蛋白伸展的空间结构变的收缩起来。通过ANS荧光探针法测得卵转铁蛋白表面疏水性指数为70.35。Zeta电位和平均粒径测定表明铁饱和度增加后,带正电荷的铁离子与带负电荷的卵转铁蛋白氨基酸残基结合更为紧密,使原本伸展的蛋白质空间结构变得紧密起来,有利于提高蛋白质的乳化性。通过AR1000流变仪测得卵转铁蛋白凝胶的临界质量分数为20%。4.卵转铁蛋白的体外抑菌试验表明：其对大肠杆菌、沙门氏菌有较好的抑制效果,在较高浓度下对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用,对三种菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为：大肠杆菌为2.5 mg/mL和10.0 mg/mL,沙门氏菌为5.0 mg/mL和15.0 mg/mL,金黄色葡萄球菌为3.5 mg/mL和12.5 mg/mL。卵转铁蛋白对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果随铁饱和度的增加而降低,相对于其它金属结合铁时卵转铁蛋白的抑菌效果较好。卵转铁蛋白能够提高机体免疫能力,增强机体抗病防病的能力,同时对预防贫血等具有很重要的意义。母乳喂养的婴儿对肠道细菌的抵抗能力比奶粉喂养的要强,某种程度上是由于母乳中含有较多的乳铁蛋白。由于卵转铁蛋白和乳铁蛋白具有相似的结构和功能,并且临床证实婴儿服用后并无异源蛋白常有的过敏等不良反应(Francesco Giansanti et al,2001)。卵转铁蛋白作为生物功能产品开发具有广阔的前景。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-14
缩略语表  14-15
第一章 文献综述  15-33
  1 转铁蛋白研究概述  15-16
    1.1 转铁蛋白的分布  15
    1.2 转铁蛋白的多态现象  15
    1.3 转铁蛋白-转铁蛋白受体系统  15-16
  2 卵转铁蛋白研究概述  16-33
    2.1 卵转铁蛋白的发现  16
    2.2 卵转铁蛋白的分离纯化方法  16-19
    2.3 卵转铁蛋白的理化性质  19-21
    2.4 卵转铁蛋白铁的摄取与释放  21-24
      2.4.1 卵转铁蛋白铁的摄取  21-22
      2.4.2 卵转铁蛋白的铁释放  22-23
      2.4.3 铁转运机理  23
      2.4.4 碳酸氢钠对卵转铁蛋白铁摄取与释放的影响  23-24
    2.5 卵转铁蛋白的生物功能  24-30
      2.5.1 铁的转运  24
      2.5.2 清除游离铁  24
      2.5.3 抗菌功能及机制  24-28
      2.5.4 免疫调节功能  28-29
      2.5.5 细胞的生长、分化和保护  29
      2.5.6 抗氧化功能  29
      2.5.7 增强机体免疫力  29-30
    2.6 卵转铁蛋白的检测方法  30
      2.6.1 紫外分光光度法  30
      2.6.2 HPLC检测卵转铁蛋白  30
      2.6.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法  30
    2.7 卵转铁蛋白的应用  30-31
    2.8 卵转铁蛋白的开发利用  31-32
      2.8.1 卵转铁蛋白作为治疗用金属的载体:铋(Bi)、钌(Ru)、钛(Ti)  31
      2.8.2 卵转铁蛋白作为诊断用放射性同位素的载体:镓(Ga)、铟(In)  31
      2.8.3 卵转铁蛋白作为药物的载体  31
      2.8.4 卵转铁蛋白作为基因治疗的载体  31-32
    2.9 结语与展望  32
    2.10 立题的意义  32-33
第二章 两步超滤法分离鸡蛋清中卵转铁蛋白的研究  33-47
  1 材料与方法  33-37
    1.1 材料  33-34
      1.1.1 材料与试剂  33
      1.1.2 主要试剂  33-34
      1.1.3 仪器与设备  34
    1.2 试验方法  34-37
      1.2.1 卵转铁蛋白超滤分离的工艺流程  34
      1.2.2 超滤装置及操作要点  34-35
      1.2.3 前处理对蛋清液粘度的影响  35-36
      1.2.4 超滤工艺条件的研究  36
      1.2.5 相对黏度的测定  36
      1.2.6 膜通量的测定  36-37
      1.2.7 SDS—PAGE电泳  37
      1.2.8 反向高效液相色谱(RP—HPLC)  37
      1.2.9 数据分析  37
  2 结果与分析  37-45
    2.1 降低蛋清液粘度的单因素试验  37-39
      2.1.1 稀释倍数对蛋清液粘度影响结果  37-38
      2.1.2 剪切速率对蛋清液粘度影响结果  38-39
      2.1.3 温度对蛋清液粘度影响结果  39
    2.2 膜通量的单因素试验  39-42
      2.2.1 物料稀释倍数对分离卵转铁蛋白膜通量的影响结果  39-40
      2.2.2 搅拌速率对分离卵转铁蛋白膜通量的影响结果  40-41
      2.2.3 操作压力对分离卵转铁蛋白膜通量的影响结果  41
      2.2.4 pH值对分离卵转铁蛋白膜通量的影响结果  41-42
    2.3 超滤最佳条件的优化结果  42-43
    2.4 SDS-PAGE电泳结果  43-44
    2.5 HPLC分析结果  44-45
  3 结论与讨论  45-47
第三章 两步层析法分离纯化鸡蛋清中的卵转铁蛋白  47-61
  1 材料与方法  47-50
    1.1 材料  47-48
      1.1.1 实验材料和试剂  47
      1.1.2 实验设备  47-48
    1.2 实验方法  48-50
      1.2.1 卵转铁蛋白铁离子的饱和  48
      1.2.2 铁饱和卵转铁蛋白的紫外特征图谱扫描  48
      1.2.3 无卵粘蛋白的制备  48
      1.2.4 硫酸铵沉淀  48-49
      1.2.5 卵转铁蛋白的纯化  49
      1.2.6 卵转铁蛋白的鉴定与纯度分析  49-50
  2 结果与分析  50-60
    2.1 卵转铁蛋白铁饱和结果  50-51
    2.2 卵转铁蛋白紫外特征图谱扫描结果  51
    2.3 硫酸铵铁饱和卵转铁蛋白的分级盐析  51-52
    2.4 Q-Sepharose Fast Flow对卵转铁蛋白纯化工艺优化结果  52-60
      2.4.1 Q-Sepharose F.F对盐析后粗卵转铁蛋白静态吸附效果的研究  52
      2.4.2 Q-Sepharose F.F.吸附凝胶的吸附动力学特征考察  52-53
      2.4.3 卵转铁蛋白的第一步层析图谱  53
      2.4.4 卵转铁蛋白的第二层析  53-58
      2.4.5 SDS-PAGE电泳结果  58
      2.4.6 HPLC分析结果  58-59
      2.4.7 纯度和得率分析结果  59-60
  3 讨论与结论  60-61
    3.1 讨论  60
    3.2 结论  60-61
第四章 卵转铁蛋白的理化性质及结构表征  61-77
  1 材料与方法  61-65
    1.1 材料  61-62
      1.1.1 实验材料和试剂  61
      1.1.2 实验设备  61-62
    1.2 实验方法  62-65
      1.2.1 卵转铁蛋白铁结合能力的测定  62
      1.2.2 卵转铁蛋白铁饱和度的测定  62
      1.2.3 pH对铁结合能力的影响  62
      1.2.4 NaHCO3浓度对卵转铁蛋白铁结合能力的影响  62
      1.2.5 热处理对卵转铁蛋白铁结合能力的影响  62-63
      1.2.6 卵转铁蛋白氨基酸的测定  63
      1.2.7 卵转铁蛋白的圆二色谱(CD)分析  63
      1.2.8 卵转铁蛋白的傅立叶红外光谱(FT-IR)分析  63
      1.2.9 表面疏水性指数测定  63-64
      1.2.10 SEM电镜扫描  64
      1.2.11 Zeta电位测定  64
      1.2.12 乳化液滴平均粒径测定  64
      1.2.13 卵转铁蛋白流变性质的测定  64-65
  2 结果与分析  65-76
    2.1 自制铁结合样品的铁结合能力与铁饱和度  65-66
    2.2 pH对铁结合能力的影响  66-67
    2.3 NaHCO_3浓度对卵转铁蛋白铁结合能力的影响  67
    2.4 热处理对卵转铁蛋白铁结合能力的影响  67-68
    2.5 卵转铁蛋白氨基酸的测定  68-69
    2.6 卵转铁蛋白的圆二色谱(CD)分析  69-70
    2.7 卵转铁蛋白的傅立叶红外光谱(FT-IR)分析  70-71
    2.8 卵转铁蛋白的表面疏水性指数测定  71-72
    2.9 卵转铁蛋白的SEM电镜分析  72-73
    2.10 卵转铁蛋白Zeta电位和乳化液滴平均粒径测定  73
    2.11 流变性质扫描  73-75
    2.12 卵转铁蛋白形成凝胶的临界质量分数测定  75-76
  3 结论与讨论  76-77
第五章 卵转铁蛋白体外抗菌研究  77-91
  1 材料与方法  77-81
    1.1 材料  77-78
      1.1.1 原料  77
      1.1.2 主要试剂  77-78
      1.1.3 主要仪器  78
    1.2 方法  78-81
      1.2.1 供试菌种的活化  78-79
      1.2.2 培养基的配制  79
      1.2.3 菌液计数  79
      1.2.4 抑菌活性的测定方法—牛津杯法  79
      1.2.5 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定  79-80
      1.2.6 不同铁饱和度卵转铁蛋白的抑菌效果  80
      1.2.7 不同金属离子对卵转铁蛋白抑菌性能的影响  80
      1.2.8 pH对卵转铁蛋白抑菌效果的影响  80
      1.2.9 卵转铁蛋白浓度对抑菌效果的影响  80
      1.2.10 热处理对抑菌效果的影响  80-81
      1.2.11 阳离子浓度对抑菌效果的影响  81
      1.2.12 卵转铁蛋白与溶菌酶的协同抑菌作用  81
  2 结果与分析  81-88
    2.1 卵转铁蛋白的抑菌活性检测结果  81-84
    2.2 卵转铁蛋白的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)  84
    2.3 铁饱和度对大肠杆菌抑菌性能的影响结果  84-86
    2.4 不同金属离子对抑菌性能的影响  86
    2.5 pH对抑菌性能的影响  86-87
    2.6 热处理程度对抑菌性能的影响  87
    2.7 阳离子对抑菌性能的影响  87-88
    2.8 卵转铁蛋白和溶菌酶的协同抑菌作用  88
  3 结论与讨论  88-91
第六章 结论  91-93
  1 结论  91-92
  2 本研究的创新点  92-93
参考文献  93-101
致谢  101-103
附录  103

相似论文

  1. 多转录因子组合调控研究,Q78
  2. 苹果多酚对γ射线引起的免疫系统损伤防护作用研究,S661.1
  3. 基于蛋白质互作网络的疾病相关miRNA挖掘方法的研究,R341
  4. 基于串核的蛋白质分类算法的研究与实现,TP301.6
  5. 扩展青霉TS414脂肪酶在毕赤酵母的表达、纯化及其催化外消旋萘普生酯化拆分的研究,Q814
  6. 米曲霉FS-1脂肪酶发酵优化、分离纯化与酶学特性的研究,TQ925.6
  7. 金花茶多糖的分离纯化及化学结构的研究,S567.19
  8. 翡翠贻贝糖胺聚糖降血脂作用的研究,R285.5
  9. 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶分离纯化与酶学特性研究,S985.21
  10. 低分子量亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备及抗肿瘤活性研究,TS254.9
  11. 罗非鱼分离蛋白的制备及其性质研究,TS254.4
  12. 珊瑚共附生可培养真菌菌群多样性及其生物活性研究,R284
  13. 云南元江干热河谷优势植物内生真菌多样性及其次生代谢产物研究,X172
  14. 雪莲果低聚果糖提取分离及分析研究,TS255.1
  15. 沸石填料水洗法提纯沼气工艺实验研究,TQ221.11
  16. Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
  17. 杨梅落果花色苷的提取、纯化及其抑菌活性研究,TQ914.1
  18. 棉铃虫和烟夜蛾生殖生物学特性比较研究,S433
  19. 棉花纤维初始发育的磷酸蛋白质组学研究,S562
  20. 高温蛋白酶Pgsey及解旋酶Htc16特征的初步研究,Q814
  21. 烟草花粉管内吞作用机制的细胞学和蛋白质组学研究,Q942

中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 营养卫生、食品卫生 > 营养学
© 2012 www.xueweilunwen.com