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小麦赤霉病相关基因的克隆及其特征研究

作　者: 郑子阳
导　师: 王心宇
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦赤霉病真菌效应蛋白酵母双杂交
分类号: S435.121
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

由禾谷镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是小麦(Triticum aest ivum)和大麦(Hordeum vulgare)的重要病害,近年来,在黄淮海平原麦区和西北麦区也多次发生大流行,造成很大损失。禾谷镰刀菌可侵染寄主植物的整个生长周期,可引起种腐、苗腐、茎腐和穗腐,其中穗腐带来的危害和损失最为严重,严重时甚至颗粒无收。而且赤霉病产生的多种衍生真菌毒素及次生代谢物质能污染粮食作物种子,人畜食用后还会引起呕吐、腹泻、头昏等急性中毒现象,并可以在食物链中长期存留,还可能产生致癌物质,严重威胁着人和动物的健康。因此,赤霉病不仅造成麦类产量的减少,而且食用价值也降低,也失去种用和工业价值。研究禾谷镰刀菌和小麦宿主互作的分子机制,以及宿主小麦细胞内病程相关基因的互作分子机制,探寻一些致病或抗病相关基因,将会对赤霉病的防治有着重要意义。本研究利用酵母双杂交技术(Y2H),和已经建立的两个抗赤霉病小麦品种苏麦3号和望水白的酵母cDN A表达文库,进行酵母双杂交筛选。以禾谷镰刀菌效应因子(effector)木聚糖酶FGX(F usarium graminearum endo-1,4-beta-xylanase NCBI登陆号AY575964)为诱饵蛋白在上述2个文库中筛选相互作用蛋白,并以筛选到的蛋白为诱饵继续进一步的对文库进行筛选。研究主要结果如下：一、克隆了禾谷镰刀菌效应因子(effector)木聚糖酶FGX,并将其克隆到酵母载体pGBKT7上,构建成诱饵载体pGBKT7-FGX,为进一步的双杂交筛选奠定了基础；二、利用构建好的诱饵分别筛选小麦品种望水白和苏麦3号的酵母表达文库发现：在苏麦3号的酵母表达文库中筛选到了一个基因命名为S16,S16是一个含有FKBP_C2 superfamily结构域的亲免蛋白(immunophilin)。该基因ORF为339bp,编码112个氨基酸,分子量为12 kDa,故命名为TaFKBP12(Trticum aestivum FK-506 binding proteins 12 kDa)。在望水白酵母表达文库中筛选到了两个基因,分别是W1,67,分别克隆全长后发现：W1氨基酸序列包含"RuBisCO-large superfamily domain"的保守结构域,该基因ORF为1431bp,编码含476个氨基酸残基的蛋白,分子量为53 kDa,通过和NCBI上进行氨基酸比对发现它是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO),故命名为TaRubisco53 (Trticum aestivum ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase 53kDa)。67属于SCP-superfamily家族,是一个病程相关蛋白,根据已报道的序列在非翻译区设计引物,我们成功克隆了该基因的全长,它的ORF为498bp,序列分析表明该蛋白全长为165个氨基酸,分子量18 kDa,故命名为TaSPRP18 (Trticum aestivum SCP pathogenesis-related proteins 18 kDa)。三、将TaFKBP12克隆到酵母载体pGBKT7上,构建成诱饵载体pGBKT7-TaFKBP12。四、通过诱饵pGBKT7-TaFKBP12对以上两个酵母文库进一步的双杂交筛选发现：在苏麦3号的酵母表达文库中筛选到一个基因(编号S15),克隆全长后发现它是一个含有C2-superfamily结构域的激发应答蛋白,该基因全长426bp,编码含141个氨基酸残基的蛋白,分子量为15kDa,命名为TaERGC2d15 (Trticum aestivu m Excitatior response gene 15 kDa)。五、通过半定量分析TaERGC2d15基因在抗病材料望水白、苏麦3号中表达情况如下：该基因在禾谷镰刀菌侵染小麦麦穗时的表达量明显低于禾谷镰刀菌非侵染时的表达量,说明该基因受禾谷镰刀菌诱导后表达下调。

小麦赤霉病相关基因的克隆及其特征研究

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