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辣椒小分子热激蛋白基因CaHSP24的克隆和表达分析

作　者: 朱巍
导　师: 巩振辉
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 辣椒高温胁迫基因克隆 CaHSP24 基因表达
分类号: S641.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

从细菌到人类的几乎所有的生物体在高温胁迫下均能产生热激蛋白,提高生物体应对高温胁迫的能力。热激蛋白(heat shock protein, HSP)按照其分子量的大小可以将其分为高分子量热激蛋白(>30kD)和小分子热激蛋白(17kD~28kD),与动物不同的是,植物中大量存在的是小分子量热激蛋白。辣椒(Capsicum annuum L.)是典型的喜温不耐热作物,目前对辣椒耐热性的研究尤其是对辣椒热激蛋白的研究比较少。本研究从辣椒耐热品种B35中克隆得到一条小分子热激蛋白基因CaHSP24,通过半定量技术分析了该基因在高温、低温、高盐、重金属、氧化等非生物胁迫下的表达,并构建了CaHSP24的原核表达载体,分析该基因对温度胁迫下大肠杆菌生活力的影响,还构建了CaHSP24的植物表达载体,为进一步通过转基因技术验证其功能奠定基础。本研究的主要结果如下:1.通过基因同源序列克隆法和RACE技术从辣椒耐热品种B35中克隆得到辣椒小分子热激蛋白基因CaHSP24(GenBank: HM132040),该基因长921bp,ORF长636bp,编码211个氨基酸。通过Blast比对和氨基酸的聚类分析发现该基因与番茄、拟南芥、小麦、玉米等线粒体小分子热激蛋白基因具有较高的同源性,其中与番茄线粒体小分子热激蛋白LeHSP23.8的同源性高达88.07%,而与甜椒细胞质Ⅰ和叶绿体小分子热激蛋白基因的亲缘关系较远。2.半定量分析发现,CaHSP24在常温32℃条件下基本不表达,在40℃高温胁迫下大量表达。该基因在40℃高温诱导0.5 h后开始表达,在辣椒耐热品种B35中表达峰值出现在处理1.5 h后,而在热敏品种B6中处理1 h后便达到表达峰值,但在B35中的表达量要显著高于B6中的表达。除了高温胁迫外,CaHSP24还能被低温、高盐、重金属、氧化胁迫等非生物胁迫诱导表达,但其表达量均显著低于其在高温胁迫下的表达。3.构建了CaHSP24的原核表达载体。试验结果显示经终浓度1 mmol/L的IPTG诱导0.5 h后,转pET28a-CaHSP24的大肠杆菌菌株BL21开始表达含CaHSP24的融合蛋白,诱导2~5 h后大量表达;通过温度胁迫试验发现CaHSP24的异源表达显著提高了高温和低温胁迫下大肠杆菌的生活力。4.构建了CaHSP24的正义和反义植物表达载体,为进一步通过转基因方法验证其生物学功能奠定了基础。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-11
第一章文献综述  11-22
  1.1 HSP 的研究进展  11-18
    1.1.1 HSP 的发现  11-12
    1.1.2 HSP 的种类和定位  12
    1.1.3 HSP 的特点  12-13
    1.1.4 HSP 的功能  13-17
    1.1.5 HSP 基因的表达调控  17-18
  1.2 线粒体小分子热激蛋白  18-20
    1.2.1 线粒体sHSP 提高植物的耐热性  19
    1.2.2 线粒体sHSP 提高植物的耐冷性  19
    1.2.3 线粒体sHSP 与植物氧化磷酸化和电子传递  19-20
  1.3 本研究的目的意义及研究内容  20-22
    1.3.1 研究的目的意义  20-21
    1.3.2 研究的内容  21-22
第二章辣椒小分子热激蛋白基因CaHSP24 的克隆  22-31
  2.1 材料  22
    2.1.1 植物材料  22
    2.1.2 菌株与质粒  22
    2.1.3 酶及生化试剂  22
    2.1.4 主要仪器  22
  2.2 方法  22-26
    2.2.1 植物材料的准备  22
    2.2.2 材料的处理  22
    2.2.3 总RNA 的提取  22-23
    2.2.4 s 合成 cDNA 第一链  23
    2.2.5 目的基因cDNA 的克隆  23-26
  2.3 结果与分析  26-29
    2.3.1 目的基因片段的克隆  26-27
    2.3.2 目的基因的克隆  27
    2.3.3 CaHSP24 同源性分析  27-29
  2.4 讨论  29-31
第三章辣椒小分子热激蛋白基因CaHSP24 的半定量分析  31-38
  3.1 材料  31
    3.1.1 植物材料  31
    3.1.2 酶及生化试剂  31
    3.1.3 主要仪器  31
  3.2 方法  31-33
    3.2.1 植物材料的准备  31
    3.2.2 材料的处理  31-32
    3.2.3 总RNA 的提取  32
    3.2.4 RNA 的纯化  32
    3.2.5 cDNA 第一链的合成  32
    3.2.6 半定量RT-PCR  32-33
  3.3 结果与分析  33-35
    3.3.1 总RNA 的提取  33
    3.3.2 cDNA 的合成  33-34
    3.3.3 半定量RT-PCR  34-35
  3.4 讨论  35-38
第四章辣椒小分子热激蛋白基因CaHSP24 的原核表达分析  38-46
  4.1 材料  38
    4.1.1 菌株与质粒  38
    4.1.2 酶及生化试剂  38
    4.1.3 主要仪器  38
  4.2 方法  38-41
    4.2.1 试验器材的准备  38-39
    4.2.2 CaHSP24 原核表达载体的构建  39
    4.2.3 pET28a-CaHSP24 重组质粒的诱导表达  39-40
    4.2.4 SDS-PAGE 检测融合蛋白的表达  40
    4.2.5 大肠杆菌生长曲线的绘制  40
    4.2.6 温度胁迫下细胞活力的检测  40-41
  4.3 结果与分析  41-44
    4.3.1 CaHSP24 原核表达载体的构建  41-42
    4.3.2 pET28a-CaHSP24 融合蛋白的诱导表达  42
    4.3.3 大肠杆菌生长曲线的绘制  42-43
    4.3.4 细胞生活力试验  43-44
  4.4 讨论  44-46
第五章辣椒小分子热激蛋白基因CaHSP24 植物表达载体的构建  46-53
  5.1 材料  46
    5.1.1 菌株与质粒  46
    5.1.2 酶及生化试剂  46
    5.1.3 主要仪器  46
  5.2 方法  46-47
    5.2.1 中间表达载体的构建  46
    5.2.2 阳性克隆质粒转化农杆菌  46-47
    5.2.3 菌落PCR 筛选阳性克隆  47
    5.2.4 酶切鉴定筛选阳性克隆  47
  5.3 结果与分析  47-50
    5.3.1 植物正义、反义表达载体的构建  47-49
    5.3.2 植物正义和反义表达载体农杆菌的转化  49-50
  5.4 讨论  50-53
第六章结论  53-55
  6.1 辣椒小分子热激蛋白基因CaHSP24 的cDNA 克隆  53
  6.2 辣椒小分子热激蛋白基因CaHSP24 的半定量分析  53
  6.3 CaHSP24 的原核表达分析  53-54
  6.4 CaHSP24 植物表达载体的构建  54-55
参考文献  55-60
附录  60-64
致谢  64-65
作者简介  65

辣椒小分子热激蛋白基因CaHSP24的克隆和表达分析

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