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3种典型纳米材料生物毒性效应研究

作　者: 刘焕亮
导　师: 袭著革
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 纳米材料肝毒性免疫毒性大鼠肺泡巨噬细胞毒性氧化损伤炎症反应
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景:随着纳米科技的迅速发展和纳米材料的广泛应用,人们对各种纳米材料和纳米颗粒的暴露程度和暴露机会也日益加重。但是由于纳米颗粒具有普通颗粒物所不具备的小尺寸效应、表面效应、量子尺度效应和宏观量子隧道效应,因而显示出不同于常规材料的热、光、电、磁、催化和敏感等特性,当其进入生态环境和生物体后有可能引发不同于普通颗粒物的特殊的生物学效应,并且不是所有的纳米材料都具有相同的毒性,其毒性受到纳米颗粒的粒径、形状或结构、表面电荷性质、表面积、化学组成以及许多未确定因素的影响,这些都对对纳米材料的安全性评价提出了挑战,所以过去宏观物质的安全性评价结果及评价方法有可能不适于纳米材料。研究显示,纳米颗粒可通过多种途径进入机体,如呼吸道、皮肤、消化道等,不仅可造成实验动物的多种组织器官损伤,并且在多水平上对生物体造成毒性作用,如动物整体水平、细胞水平、亚细胞水平、蛋白及基因水平等。其负面影响也可能是全方位的,包括哮喘、肺气肿、肺组织纤维化等肺部毒性和心血管毒性、神经毒性、皮肤毒性、胚胎毒性及遗传突变等。但是有关纳米材料免疫毒性方面的报道很少。本研究采用非暴露式气管滴注染毒方式,研究了纳米银、纳米氧化锌和纳米二氧化钛对大鼠呼吸道免疫和整体免疫毒性效应,并对三种纳米材料对大鼠肺泡巨噬细胞的毒性效应进行了初步探讨,为进一步进行作用机制的研究及纳米颗粒经呼吸道进入机体后的毒性效应评价提供科学依据。研究内容:（1）研究三种纳米材料的一般毒性效应;（2）研究三种纳米材料致大鼠呼吸道免疫毒性效应;（3）研究三种纳米材料致大鼠整体免疫毒性效应;（4）三种纳米材料致大鼠肺泡巨噬细胞毒性效应的初步探讨。研究方法:（1）纳米材料染毒悬液的制备及参数表征:选择3种典型的纳米材料:纳米银（Nano-Ag）、纳米二氧化钛（Nano-TiO₂）和纳米氧化锌（Nano-ZnO）,以新生小牛血清制备纳米颗粒悬液,并在透射电镜下观察纳米颗粒的分散状态,对其粒径、形状和化学组成基本颗粒参数进行表征。（2）通过动物整体实验对3种纳米材料的一般毒性效应进行评价:采用气管内滴注方式染毒雄性Wistar大鼠,分为小牛血清对照组、高剂量染毒组17.5mg.kg-1、低剂量染毒组3.5mg.kg-1,隔日滴注1次,共5周,检查大鼠体重变化和肝、肾、胸腺、脾的脏器系数及肝组织病理变化,通过测定肝组织匀浆液和外周血血清中氧化损伤指标超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）活性和丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量,反应肌体氧化应激水平。（3）通过整体动物实验研究三种纳米材料对大鼠呼吸道免疫及整体免疫毒性效应:检测肺组织及免疫器官脾、胸腺的组织病理学改变,反映主要脏器及免疫系统的实质性变化;通过检测肺泡灌洗液（BALF）及脾、胸腺组织匀浆液中SOD活性和GSH、MDA、NO含量反应肺组织及免疫器官的氧化应激水平;通过检测肺组织匀浆中细胞因子白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量反应对呼吸道免疫功能的影响。采用免疫组化方法检测外周血T淋巴细胞亚群的变化,反应对机体细胞免疫功能的影响;通过检测大鼠外周血细胞分类计数及血清中细胞因子IL-1、IL-6、干扰素γ（INF-γ）、TNF-α的含量反应对大鼠整体免疫功能的影响。（4）通过体外细胞实验研究纳米材料对大鼠肺泡巨噬细胞（AM）的毒性效应:将3种纳米材料配制成由高到低依次为200、100、50、25、10、5、2.5μg/ml的混悬液,分别染毒原代培养2～3d的AM细胞,染毒时间为24h、48h、72h,通过细胞形态学观察、WST实验和乳酸脱氢酶（LDH）检验研究纳米材料对细胞活性的影响;通过中性红吞噬实验研究纳米材料对细胞吞噬功能的影响,反应对细胞非特异性防御能力的影响。研究结果:1整体动物水平实验研究（1）一般毒性效应:3种纳米材料均可致大鼠体重较对照组显著降低,而对肝、肾、脾、胸腺脏器系数没有显著影响;可导致肝组织病理性改变,诱发大鼠肝组织炎症;氧化损伤结果显示,3种纳米材料均可导致肝组织匀浆中SOD活性、GSH含量显著下降,MDA浓度显著升高;血清中GSH含量显著下降,MDA和NO含量显著升高,纳米氧化锌高、低剂量组及纳米银高剂量组SOD活性显著下降。（2）呼吸道免疫毒性效应:3种纳米材料均能诱发大鼠肺部炎症,导致肺泡结构破坏、纤维组织增生和形成小脓肿;氧化损伤结果显示,与对照组相比,3种纳米材料均可导致BALF中SOD活性（纳米二氧化钛除外）、GSH含量显著下降,MDA、NO浓度显著升高。炎性因子检测结果显示,与对照组相比,染毒组TNF-α含量（除纳米二氧化钛与纳米银低剂量组外）、MIP-2含量（除纳米二氧化钛外）及纳米银组IL-6含量显著升高,但对IL-1无影响。对3种纳米材料的呼吸道免疫毒性进行比较,纳米氧化锌与纳米银毒性较大而纳米二氧化钛相对较弱。（3）整体免疫毒性效应:纳米氧化锌高剂量组白细胞总数显著升高,低剂量组单核细胞数显著降低,其他各组白细胞总数及淋巴细胞总数均有降低的趋势,同时各染毒组粒细胞呈下降趋势,且纳米氧化锌和纳米二氧化钛低剂量组呈显著性差异。3种纳米材料可使染毒大鼠外周血辅助性T细胞（CD4+）降低,而抑制性T细胞（CD8+）上升,继而造成CD4+/CD8+比值较对照组显著降低。氧化损伤结果显示,与对照组比较,脾、胸腺组织匀浆中纳米氧化锌高、低剂量组GSH含量显著降低;各染毒组脾组织匀浆中MDA含量均显著升高,胸腺匀浆中纳米氧化锌高剂量组和纳米银高、低剂量组MDA含量显著升高;胸腺匀浆中SOD活性显著降低,脾匀浆中纳米氧化锌高、低剂量组和纳米银高剂量组SOD活性显著降低。炎性因子结果显示,与对照组相比,血清中IL-1含量除纳米纳米氧化锌及纳米银低剂量组外均显著升高;纳米二氧化钛和纳米银高剂量组IFN-γ含量显著降低;纳米银低剂量组TNF-α含量显著升高,而纳米银高剂量组及纳米氧化锌和纳米二氧化钛低剂量组TNF-α含量显著降低。对3种纳米材料的全身免疫毒性进行比较,纳米氧化锌毒性最强,纳米银次之而纳米二氧化钛相对较弱。2体外细胞水平实验研究（1）AM形态学:对照组AM细胞形态正常,胞质透明度较大。染毒组细胞出现不同程度的回缩变形,变圆漂浮、胞核固缩、胞内形成许多空泡,细胞突起和伪足明显减少,甚至消失;胞质内颗粒物增多,透明度下降,细胞间隙和细胞表面有纳米颗粒分布,对细胞的生长和代谢造成显著影响,导致活细胞数明显减少。（2）细胞存活率:3种纳米颗粒染毒24h后,除了5μg/ml剂量水平的纳米二氧化钛外,3种纳米颗粒在5～200μg/ml各剂量水平上均可造成AM细胞活性较对照组显著降低,且其毒性随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长而增强。24h后各染毒组AM细胞活性的降低趋于缓慢,逐渐进入平台期,其中Nano-ZnO组细胞活性降低最为明显,其次是纳米银。纳米颗粒作用24h后,各染毒组细胞培养液上清中LDH活性均较对照组升高,且纳米氧化锌和二氧化钛在25～100μg/ml各剂量水平上均显著高于对照组,而纳米银在染毒剂量达10μg/ml时即已经显著高于对照组,并且均呈现出剂量依赖性。（3）细胞吞噬功能:各染毒组细胞对中性红的吞噬功能在10～100μg/ml的各剂量水平上均显著低于对照组,且随着染毒剂量的增加而降低。各纳米材料染毒组之间也表现出差异性,AM细胞的吞噬功能由强至弱依次为:Nano-Ag暴露组、Nano-ZnO暴露组和Nano-TiO₂暴露组。研究结论:（1）3种纳米材料暴露可对肝、肺组织及免疫系统造成氧化损伤,机体抗氧化水平降低,清除自由基的能力显著下降,且可对肝、肺组织造成病理性损伤;氧化应激机制可能是纳米颗粒引发机体免疫毒性效应的主要方式之一。（2）3种纳米材料可刺激机体免疫系统产生免疫应答,发挥免疫调节作用,细胞因子网络调节紊乱,表现出不同程度的细胞免疫功能紊乱和免疫抑制或免疫增强。（3）3种典型纳米材料均能够引起AM细胞活性下降;可通过影响细胞膜的完整性和通透性抑制细胞活性,可使AM细胞的吞噬功能显著降低,引起AM细胞结构和完整性的破坏,从而影响其对颗粒物的吸附和吞噬作用,消弱其非特异性防御能力。（4）3种纳米材料间比较,氧化锌的毒性较大,纳米银次之,纳米二氧化钛相对较弱,其差异可能与其粒径、结构特征及化学组成的不同有关,亦即ZnO、TiO₂、Ag化学性质的不同。

全文目录

摘要  5-9
Abstract  9-14
缩略词表  14-16
前言  16-21
第一章三种典型纳米材料暴露对大鼠整体毒性效应研究  21-66
  第一节三种典型纳米材料对染毒大鼠的一般毒性效应  22-33
    1 实验材料  22
    2 实验方法  22-26
    3 结果  26-31
      3.1 染毒悬液中纳米材料参数的鉴定  26
      3.2 纳米材料对大鼠体重和肝、肾、脾、胸腺脏器系数的影响  26-28
      3.3 纳米材料对大鼠肝组织的氧化损伤作用  28
      3.4 纳米材料对大鼠肝、肾组织的病理损伤结果  28-31
    小结  31-33
  第二节三种典型纳米材料对大鼠的呼吸道免疫毒性效应研究  33-43
    1 实验材料  33-34
    2 实验方法  34-36
    3 结果  36-41
      3.1 纳米材料对大鼠BALF中几种氧化损伤指标的影响  36-37
      3.2 纳米材料对大鼠BALF中几种细胞因子的影响  37-38
      3.3 纳米材料对大鼠肺组织的病理损伤结果  38-41
    小结  41-43
  第三节三种典型纳米材料对大鼠的整体免疫毒性效应研究  43-57
    1 实验材料  43-44
    2 实验方法  44-47
    3 结果  47-54
      3.1 纳米材料对大鼠血常规的影响  47-48
      3.2 纳米材料对大鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响  48-49
      3.3 纳米材料对大鼠外周血血清中几种细胞因子的影响  49-50
      3.4 纳米材料对大鼠外周血血清中几种氧化损伤指标的影响  50-51
      3.5 纳米材料对大鼠脾脏的氧化损伤作用  51-52
      3.6 纳米材料对大鼠胸腺的氧化损伤作用  52-53
      3.7 纳米材料对大鼠脾、胸腺组织病理损伤结果  53-54
    小结  54-57
  分析与讨论  57-66
第二章三种纳米材料对大鼠肺泡巨噬细胞的毒性效应研究  66-87
  本章节的技术路线  67
  1 实验材料  67-68
  2 实验方法  68-71
  3 结果  71-82
    3.1 大鼠AM细胞的培养与鉴定  71-73
    3.2 细胞染毒24h后形态学的改变  73
    3.3 纳米材料对AM细胞活性的影响  73-80
      3.3.1 纳米材料对AM细胞活性影响的时间—效应关系  73-78
      3.3.2 纳米材料对AM细胞活性影响的剂量—效应关系  78
      3.3.3 纳米材料对AM细胞活性的影响  78-80
    3.4 纳米材料对AM细胞外LDH活性的影响  80-81
    3.5 纳米材料对AM细胞吞噬功能的影响  81-82
  小结  82-85
  分析与讨论  85-87
结论  87-89
参考文献  89-97
文献综述全文  97-106
  参考文献  103-106
发表论文全文（一）  106-114
发表论文全文（二）  114-122
录用待发表论文全文  122-131
致谢  131

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