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米糠谷维素抗急性肠炎的功能评价及初步机理研究

作　者: 李辉
导　师: 林亲录
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 食品科学
关键词: 谷维素溃疡性结肠炎功能机理
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

我国是世界最大的稻米生产国,年产稻谷高过2.0亿吨以上。米糠——稻米加工的副产物,我国米糠年产量可达1400万吨左右。米糠含有丰富的多糖、蛋白质、脂肪、纤维素、矿物质及B族维生素、生育三烯酚等生理功能活性物质,其中,米糠中丰富的谷维素含量使其倍受瞩目。谷维素为脂溶性不皂化物,是环木菠萝醇同系物及植物醇的阿魏酸酯的混合物,具有抗氧化、清除自由基、降低血脂和胆固醇等生理功能。近年来研究发现谷维素可能具有抗炎的生理功能,在临床上有研究人员联合应用谷维素与其它抗炎药物防治炎症,发现谷维素能增强疗效。然而,迄今为止谷维素是否具有抗炎作用,谷维素抗炎的分子机理尚不清楚。本研究将小鼠炎症动物模型,评估谷维素的抗炎作用及其可能分子机理。本实验采用葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium, DSS)结肠炎模型模拟人类溃疡性结肠炎,探究米糠谷维素对DSS模型小鼠炎症的防治作用。葡聚糖硫酸钠结肠炎模型的组织学特点、发病部位、临床表现以及细胞因子增殖情况都与人类的溃疡性结肠炎极为相似,是经典的人类结肠炎模型。通过让小鼠自由饮用5.0%DSS水7天建立急性结肠炎模型,引发小鼠结肠炎症,在造模前三天开始灌胃小鼠玉米油溶的谷维素,以探究谷维素对小鼠肠炎的防治作用。小鼠饮用DSS后,对模型小鼠的体重,结肠重量与长度以及脾脏重量等炎症影响因素进行分析统计,经过DAI评分,宏观上考察谷维素对DSS导致的小鼠溃疡性结肠炎的防治作用。可以观察到DSS损伤组小鼠结肠上皮粘膜糜烂,损伤严重,谷维素对其损伤具有部分的抑制作用。小鼠结肠病理学分析显示：切片HE染色后,可明显观察到DSS损伤组小鼠结肠上皮粘膜,腺体隐窝结构被DSS破坏,淋巴细胞及伴中性粒细胞等浸润,杯状细胞丢失,防治组小鼠结肠损伤明显减轻,上皮结构相对完整,隐窝结构完整,排列比较整齐,炎症细胞侵润得到缓解。DAI评分值分别为：0.31±0.42、9.21±2.32和7.18±2.02,通过对对照组,DSS损伤组,防治组小鼠的疾病活化指数进行评分,发现损伤组小鼠DAI评分明显高于对照组以及防治组(P<0.01)。给予小鼠一段时间的谷维素灌胃处理,小鼠的DAI评分显著降低,小鼠体重下降得以缓解,结肠重量升高,结肠萎缩改善,结肠隐血、便血程度降低,炎症细胞侵润缓解,结肠炎症得到改善。小鼠体重的测量结果显示造模第六天,DSS模型组小鼠可明显观察到懒动、厌食、喜扎堆、体毛光泽度下降等状态,体重也显著下降。进行统计学分析,对照组小鼠,损伤组小鼠以及防治组小鼠体重分别为：19.85±1.05、15.23±1.02和16.88±0.98克。相对于对照组小鼠,损伤组小鼠体重下降,并有显著差异(P<0.05)。防治组体量小于对照组,高于损伤组(P<0.05)。可见谷维素对DSS导致的溃疡性结肠炎小鼠的体重降低具有一定的缓解作用。统计学分析结肠炎小鼠炎症最相关的宏观指示(结肠重量及长度),结果发现：对照组小鼠、损伤组小鼠以及防治组小鼠结肠重量分别为：177.6±7.8mg、202.8±13.6mg和190.3±9.7mg。相对于对照组小鼠,损伤组及防治组小鼠结肠重量均显著升高,差异极显著(P<0.01)。防治组结肠重量高于对照组,低于损伤组(P<0.01)。损伤组及防治组小鼠结肠长度均有明显缩短,对照组小鼠,损伤组小鼠以及防治组小鼠结肠长度分别为：7.95±0.44cm、5.95±0.27cm和6.5±0.32cm,差异显著(P<0.05),DSS药物作用使小鼠结肠发生萎缩,长度缩短。防治组结肠长度低于对照组,高于损伤组(P<0.05)。谷维素对DSS导致的小鼠溃疡性结肠炎模型结肠重量上升,结肠萎缩明显的改善,提示谷维素具有抗DSS-诱导的结肠炎作用。脾脏是最大的淋巴器官,其中含有大量的效应B细胞,结肠炎由于炎症的产生及免疫功能紊乱,会发生免疫反应,导致小鼠脾脏增大。结果发现：免疫系统紊乱导致损伤组、防治组小鼠脾脏增大,对照组小鼠,损伤组小鼠以及防治组小鼠脾脏重量分别为：79.8±7.6mg、152.1±42.1mg和129.1±28.1mg,小鼠灌胃后,谷维素能有效抑制脾脏肿大(P<0.05)。提示谷维素能够部分改善溃疡性结肠炎小鼠免疫系统紊乱,有效对抗因造模引起的脾脏增大,但谷维素不能像激素一样,达到抑制免疫的作用。谷维素抑制结肠炎的分子机理可能与抑制小鼠脾脏的肿大(抑制脾脏炎症)有关。COX-2是结肠炎症重要的靶基因,研究发现,COX-2作为花生四烯酸转化生成前列腺素的限速酶,与炎症有着密切的关系。在正常机体内,COX-2几乎不表达,然而,在炎症组织中,受到炎症细胞因子、表皮生长因子、脂多糖、肿瘤坏死因子等炎性因子诱导时,才会有大量COX-2表达。本实验中,DSS导致的小鼠结肠炎模型中COX-2的mRNA表达显著升高,结肠炎症反应发生。添加谷维素后,防治组的COX-2表达较损伤组下降,说明谷维素可以干预COX-2蛋白的产生,影响炎症的发生。iNOS是结肠炎症另一个重要的靶基因,是一种诱导性酶,能够将体内精氨酸转化为瓜氨酸并释放NO。大量NO的释放会产生很多自由基,引起组织损伤,引发炎症,测定结肠黏膜iNOS水平可反映肠道炎症状况。灌胃谷维素的小鼠,结肠组织内iNOS的表达含量较DSS损伤组显著下降,说明谷维素能够抑制炎症细胞iNOS的表达,从而缓解炎症危害。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-12
英文缩写注解  12-13
1 研究背景  13-21
  1.1 谷维素的来源-米糠  13
  1.2 米糠中的营养物质  13-14
  1.3 米糠中的谷维素提取  14-15
  1.4 谷维素的生理功能  15-18
    1.4.1 抗氧化功能  15-16
    1.4.2 降低血脂的作用  16-17
    1.4.3 抗肿瘤作用  17
    1.4.4 植物神经调节剂  17
    1.4.5 抗炎症  17-18
  1.5 溃疡性结肠炎模型  18-19
  1.6 结肠炎的发病机制  19-21
    1.6.1 COX-2与炎症的关系  19-20
    1.6.2 iNOS与炎症的关系  20-21
2 材料与方法  21-29
  2.1 实验材料  21-23
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 实验试剂  21-22
    2.1.3 实验仪器  22-23
  2.2 实验方法  23-29
    2.2.1 溶液的配制  23
    2.2.2 UC模型的建立及动物分组  23
    2.2.3 DAI评分  23-24
    2.2.4 病理组织学评分  24-25
    2.2.5 组织总RNA的提取  25-26
    2.2.6 检测RNA的完整性  26
    2.2.7 消化RNA中的DNA  26
    2.2.8 逆转录(cDNA合成)  26-27
    2.2.9 Real-time PCR扩增  27-29
3 实验结果  29-37
  3.1 谷维素抗炎功能的评价  29-34
    3.1.1 谷维素对DSS诱导小鼠体重的影响  29
    3.1.2 谷维素对DSS诱导小鼠结肠重量与长度的影响  29-31
    3.1.3 谷维素对DSS诱导小鼠脾脏重量的影响  31-32
    3.1.4 谷维素对DSS诱导小鼠结肠组织病理特征(HE分析)的影响  32-33
    3.1.5 谷维素对DSS诱导小鼠DAI评分的影响  33-34
  3.2 谷维素对促炎因子表达的影响  34-37
    3.2.1 RNA提取完整性分析  34-35
    3.2.2 谷维素对DSS诱导的结肠COX-2、iNOS基因表达的影响  35-37
4 讨论与分析  37-41
5 结论  41-43
6 创新点  43-45
参考文献  45-53
综述一 γ-生育酚抗癌作用研究的进展  53-61
  参考文献  57-61
综述二近红外光谱法测定大米直链淀粉探究  61-67
  参考文献  64-67
附录A 攻读硕士学位期间发表的论文  67-69
致谢  69

米糠谷维素抗急性肠炎的功能评价及初步机理研究

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