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改良HBSS液对体外培养人牙周膜细胞生物学活性的影响

作　者: 李鑫
导　师: 段建民
学　校: 南方医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 牙脱位牙周膜器官保存液谷胱甘肽
分类号: R781
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景牙齿外伤为儿童和青少年常见的口腔颌面部损伤之一,其发生率为15-21%,而牙脱位(美国儿科牙学会将其定义为“牙齿完全从牙槽窝中移位”)是牙齿外伤中最严重的一种,约占恒牙外伤的16%。当牙脱位时,除了牙周膜(periodontal ligament, PDL)完全撕裂外,还伴有局部牙骨质、牙槽骨和附着组织的损伤以及牙髓坏死等。牙脱位若治疗不当则很容易造成牙齿缺失,影响到伤者的面容美观和咀嚼功能,更有甚者还有可能影响到青少年伤者的心理健康发育。治疗牙脱位的最好方法是即刻再植,即刻再植不仅能迅速恢复PDL的营养支持,而且能最大化地维持牙根面牙周膜细胞(periodontal ligament cells, PDLC)的活性和增殖能力,提高功能性愈合(functional healing, FH)的几率,进而能最大限度的保存患牙,维护牙列的完整性和美观性。虽然即刻再植治疗脱位牙能得到最好的预后,但即刻再植通常很难实现。不过,对于不能即刻再植的脱位牙则应最大限度地保存残留在牙根面上的PDLC活性,来提高脱位牙延时再植的成功率。据报道,牙根面存留的有活性的PDLC随着体外干燥时间的延长而减少,脱位牙体外干燥2h后根面几乎找不到活细胞。Cvek等的调查研究显示脱位后干燥放置15min、20～40min和60min的牙齿再植后分别有13%、40%和100%的牙齿发生了置换性吸收,而造成再植牙失败的主要原因是牙根的炎症性吸收(inflammatory resorption, IR)和置换性吸收(replacement resorption, RR)。 Andreasen JO对影响再植牙形成FH的因素进行分析后发现,对形成FH有影响的因素由强至弱依次为牙根发育阶段、体外干燥放置时间、即刻再植和体外湿保存时间。再有,许多研究结果显示与缩短口外放置时间比较,用保存介质保存PDLC活性来预防脱位牙再植后的RR和IR则更为关键。理想的脱位牙保存介质应具有生理性渗透压和pH值、能保存PDLC的活性、粘附力和增殖能力、以及容易获得且保质期长等特性。HBSS液(Hank’s balanced salt solution)是美国牙髓医师学会推荐的最佳牙齿保存液,含有细胞生存所必需的营养物质,渗透压290-320mOsm/L,pH值7.2,适宜细胞生长。但是因为在药店里无售而一直没有被广泛使用。牛奶因为含细菌量低,并且含有少量细胞生长所需的营养物质和生长因子而被广泛接受,但是它的效果是否与HBSS液一样还存在争议,有报道认为它只能在3h内保存细胞活性。器官保存液ViaSpan(?)也被研究用做PDLC的保存介质,它能有效保存唇成纤维细胞活性至168h,且在ViaSpan(?)中保存6h和12h的狗牙再植后既未发生IR,也未发生RR。虽然ViaSpan(?)毙长时间地保存细胞活性,但因价格昂贵而不适于普遍使用。Buttke TM认为ViaSpan(?)含有的还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)能分解过氧化氢,保护PDLC免受氧化损伤；他的研究也证实在添加了100U/ml过氧化氢酶的HBSS液中保存过的狗脱位牙,再植后的根面吸收率显著低于未添加过氧化氢酶的HBSS液组。德国Dentosafe(?)公司生产了一种名为牙科急救箱的脱位牙齿保存液,被瑞士和澳洲引进放在易发生牙外伤的高风险区——中小学校,体外实验表明这种牙齿保存液能在室温下保存PDLC活性和增殖能力至48h。有报道对使用了牙科急救箱的6颗脱位牙做了长期随访,保存时间为1-53h,这些牙齿再植后全部形成了牙周膜愈合。由此可见,选择适当的保存介质湿保存脱位牙,对于保存牙根面PDLC的活性,提高再植牙的FH是非常重要的。目前我国对脱位牙齿保存液的研究甚少,也没有商业化的脱位牙齿保存液出售,本研究目的是以HBSS液为基础,将配制的改良HBSS液与HBSS液比较,探讨其保存人PDLC生物学活性的效果,进而为研究商业化脱位牙齿保存液提供初步实验依据。第一章人PDLC的原代培养及细胞来源鉴定目的：体外分离培养人PDLC,对细胞来源进行鉴定。方法：1、分离培养人PDLC门诊收集因正畸需要拔除的无龋坏及其它牙体、牙周组织疾病的上颌或下颌前磨牙,刮取根中1/3牙周膜组织,采用酶消化联合组织块法培养。消化液由3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml中性蛋白酶以体积比1：1混合而成。2、人PDLC来源鉴定通过免疫组织化学方法检测培养细胞的波形丝蛋白和角蛋白的表达,对细胞来源进行初步鉴定。3、绘制人PDLC生长曲线用MTS试剂测定并绘制培养的人PDLC生长曲线。结果：1、形态学特征：原代培养第5d即可看到细胞从组织块游出,细胞形态无明显差别,多数呈长梭形,少数为多角形,纺锤状,体积较小,内有圆形细胞核。原代培养12d细胞即达到80%汇合,此时细胞连接成片,排列具有一定的方向性,呈漩涡状。经HE染色可见细胞核呈圆形蓝染,胞质红染。2、免疫组织化学特征：免疫组化显示细胞抗波形丝蛋白染色阳性,胞质内有褐色阳性颗粒均匀分布,而抗角蛋白染色阴性,胞质内未见褐色阳性颗粒,表明细胞较为单一,符合间叶来源细胞特征,且无上皮细胞污染,证实所分离培养的是人PDLC,可用于进一步的研究。3、生长曲线特点：经MTS法测得的人PDLC生长曲线显示,细胞接种后48h内生长缓慢,此后细胞生长逐渐加快,第3d进入对数生长期,第7d进入平台期。第二章改良HBSS液对体外培养人牙周膜细胞增殖活性的影响目的：以HBSS液为基础液配制成改良HBSS液,用MTS法检测改良HBSS液保存的体外培养人PDLC增殖活性的变化。方法：1、在HBSS液中添加终浓度各为100U/ml的青霉素和链霉素,无水酒精溶解地塞米松后加入HBSS液中使其终浓度为8mg/L。将上述HBSS液充分混匀后分成三等份,分别添加GSH使其终浓度分别为1mmol/L、3mmol/L和5mmol/L,然后用NaOH调节pH值在7.2-7.4之间,最后过滤消毒待用。2、取生长良好的第4代人PDLC铺于96孔板,用MTS法测定人PDLC于室温(25℃)下在上述三种改良HBSS液、HBSS液、HC-A离体肾保存液及蒸馏水中存放0.5～48h后的增殖活性变化。结果：1、MTS法检测结果显示：HBSS液组和改良HBSS液组的细胞增殖活性(OD值)在0.5～48h内均显著高于HC-A液组和蒸馏水组(P<0.05), HC-A液组和蒸馏水组之间差异始终无显著意义(P>0.05)；含3mmol/L和5mmol/LGSH的改良HBSS液组在1-12h显著高于HBSS液组(P<0.05)；含lmmol/LGSH的改良HBSS液组在2-6h显著高于HBSS液组(P<0.05),其中,含5mmol/LGSH改良HBSS液组在2-12h显著高于含GSH的其它浓度组(P<0.05)。但含1mmol/LGSH的改良HBSS液组在1h、12h时与HBSS液组差异无显著意义(P>0.05)；另外,改良HBSS液组与HBSS组在24～48h间均差异无显著意义(P>0.05)。第三章改良HBSS液对体外培养人牙周膜细胞存活和克隆能力的影响目的：用台盼蓝染色法和细胞平板克隆形成实验检测改良HBSS液保存体外培养人PDLC的效果。方法：1、取生长良好的第4代人PDLC,在上述三种改良HBSS液、HBSS液及蒸馏水中保存0.5～48h后,用台盼蓝染色法鉴定活细胞与死细胞,并计算存活细胞百分率。2、未用于台盼蓝染色的细胞悬液作梯度倍数稀释,以50,100,200个细胞的密度分别接种至含2.5ml37℃预温培养液的6孔板中,继续培养至肉眼能看到克隆时终止培养,并计算存活细胞克隆形成率。结果1、存活细胞百分率：含3mmol/L和5mmol/L GSH的改良HBSS液组在2～24h显著高于HBSS液组,且含5mmol/L GSH的改良HBSS液组在2～24h时显著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液组(P<0.05),含3mmol/L GSH的改良HBSS液组在6-24h显著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液组(P<0.05)；含3mmol/L和5mmol/L GSH组之间差异始终无显著意义(P>0.05)；含1mmol/L GSH的改良HBSS液与HBSS液组之间差异始终无显著意义(P>0.05)；改良HBSS液组和HBSS液组在0.5、1h及48h时差异始终无显著意义(P>0.05)。而蒸馏水组在0.5h时已无细胞存活。2、存活细胞克隆形成率：含5mmol/L GSH的改良HBSS液组在1-12h显著高于HBSS液组(P<0.05),在2-12h显著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液组(P<0.05),在6-12h时显著高于含3mmol/L GSH的改良HBSS液组(P<0.05)；含3mmol/L GSH的改良HBSS液组在1-6h显著高于HBSS液组(P<0.05),仅在2h时显著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液组(P<0.05)；含1mmol/L GSH的改良HBSS液仅在6h时显著高于HBSS液组(P<0.05); HBSS液组和改良HBSS液组的克隆形成率在0.5、24h及48h时差异始终无显著意义(P>0.05)。结论1、改良HBSS液在12h内保存的人PDLC增殖活性以及存活细胞克隆形成率均明显高于HBSS液,而且这种效果随GSH浓度的升高而增强。2、含5mmol/L GSH的改良HBSS液是较好的体外培养人PDLC保存液。

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