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豚鼠实验性近视眼巩膜成纤维细胞的力学特性变化及其与色素上皮细胞和部分细胞因子关系的研究

作　者: 陈博宇
导　师: 马景学
学　校: 河北医科大学
专　业: 外科学
关键词: 近视凹透镜诱导视网膜色素上皮细胞巩膜成纤维细胞细胞增殖转化生长因子β2 转化生长因子受体β2 碱性或纤维细胞生长因子基质金属蛋白酶微管吸吮
分类号: R778.11
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：建立豚鼠镜片诱导型近视眼模型(Lens induced myopia, LIM),观察前部及后极部视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelial cells, RPE)细胞及巩膜成纤维(Scleral fibroblasts, SF)细胞的生长周期变化,观察RPE细胞和SF细胞内基质金属蛋白酶(matrix metallopeptidase2, MMP-2)、转化生长因子-β2(transforming growth factor-beta2, TGF-(32)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的表达变化；观察外源性转化生长因子(TGF-β2)对豚鼠眼球前部及后极部SF细胞生长周期的影响,观察TGF-β2对豚鼠眼球前部及后极部SF细胞基质金属蛋白酶(MMP-2)、转化生长因子-β2受体(Transforming Growth Factor-β receptor type2, TβR II)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)衣达的影响；结合TGF-β2对细胞力学特性的影响,观察SF细胞的力学特性变化。方法：取出生后2周龄的豚鼠30只(60只眼)雌雄不限,分为A、B、C三组,每组10只,随机选取一只眼为实验眼(LIM眼),对侧眼为自身对照眼(Self-control, SC眼)。实验眼采用离焦点方法,用-10.00D凹透镜诱导成近视眼模型。 A、B、C三组试验眼-10.00D凹透镜诱导时间分别为6天、15天、30天。实验前后检测每组豚鼠双眼屈光状态,用A超测双眼眼轴长度。另取5只(10眼)豚鼠不作任何干预,作为正常对照眼(Norma-contro, NC组)。细胞酶消化法原代培养豚鼠眼球前部及后极部RPE细胞,并传2代。免疫细胞化学法鉴定培养的细胞,利用免疫细胞化学法、荧光定量PCR (Q-PCR)法和Western Blot法对每组实验眼和对照眼前部及后极部RPE细胞的TGF-β2、bFGF的表达进行半定量及定量检测；用流式细胞仪检测每组实验眼和对照眼前部及后极部RPE细胞的生长周期。结果用SPSS13.0统计软件进行统计分析。组织块培养法培养豚鼠眼球前部及后极部SF细胞,并传2代。免疫细胞化学法鉴定培养的细胞,免疫细胞化学法、荧光定量PCR (Q-PCR)法和Western Blot法对每组实验眼和对照眼前部及后极部SF细胞MMP-2、 TGF-β2、 bFGF的表达进行半定量及定量检测；用流式细胞仪检测每组实验眼和对照眼前部及后极部SF细胞的生长周期；利用细胞微管吸吮的方法测定每组实验眼和对照眼前部及后极部SF细胞的力学特性。结果用SPSS13.0统计软件进行统计分析。用组织块培养法培养豚鼠后极部SF细胞并传2代,免疫细胞化学法鉴定培养的细胞。将不同质量浓度的TGF-β2(分别为0、1、10、100ng/ml)加入无血清DMEM中作用24h,利用免疫细胞化学法、荧光定量PCR (Q-PCR)法和Western Blot法对每组实验眼和对照眼后极部SF细胞MMP-2、 TβRⅡ、bFGF的表达进行半定量及定量检测；用流式细胞仪检测每组后极部SF细胞的生长周期；用细胞微管吸吮的方法测定各组实验眼和对照眼SF细胞的力学特性。结果用SPSS13.0统计软件进行统计分析。结果：1RPE细胞和SF细胞中TGF-β2、 bFGF、 MMP-2的表达：免疫细胞化学、荧光定量PCR (Q-PCR)及Western Blot去结果显示：①A、B、C三组实验眼和对照眼前部及后极部RPE、 SF细胞均有TGF-β2的表达,三组实验眼前部及后极部与自身对照眼相应前部及后极部比较,实验眼中TGF-β2的阳性率高于自身对照眼(P<0.05)。实验眼中前部RPE细胞、前部SF细胞于15天阳性率增高,30天阳性率最高；后极部RPE和SF细胞于6天阳性率开始增高,至15天阳性率最高,以后保持较高的阳性率(P<0.05)；30天时后极部RPE细胞、SF细胞TGF-β2的阳性率明显低于同期前部RPE细胞、SF细胞阳性率(P<0.05)；三组自身对照眼自身前部及后极部RPE、 SF细胞TGF-β2阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②A、B、C三组实验眼和对照眼前部及后极部RPE细胞、SF细胞均有bFGF的表达,实验眼前部及后极部与自身对照眼相应前部及后极部比较,实验眼中bFGF的阳性率低于自身对照眼,差异有显著统计学意义(P<0.05)。而且,随着诱导时间的延长,A、B、C三组实验眼的阳性率逐渐降低,差异有显著统计学意义(P<0.05), A、 B、 C三组自身对照眼的阳性率不变,差异无统计学意义(P>0.05)；实验眼和自身对照眼各组自身前部及后极部比较,差异无统计学意义(P>0.05)。③A、B、C三组实验眼和对照眼前部及后极部SF细胞均有MMP-2的表达,实验眼前部及后极部与自身对照眼相应前部及后极部比较,(LIM组)实验眼中MMP-2的阳性率高于自身对照眼(P<0.05)。实验眼中前部SF细胞于15天阳性率增高,30天阳性率最高；后极部SF细胞于6天阳性率开始增高,至15天阳性率最高,以后保持较高的阳性率(P<0.05)；30天时后极部SF细胞MMP-2阳性率仍明显低于同期前部SF细胞阳性率(P<0.05)；各组自身对照眼自身前部及后极部SF细胞MMP-2阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2TGF-β2对SF细胞MMP-2.TβRⅡ、bFGF表达的影响免疫细胞化学、荧光定量PCR(Q-PCR)及Western Blot法结果显示：实验眼0ng/ml TGF-β2组与对照眼0ng/ml TGF-β2组比较,实验眼MMP-2的阳性率明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。实验眼和对照眼SF细胞在TGF-β2浓度为10ng/ml时MMP-2的阳性率最高(P<0.05)。实验眼0ng/ml TGF-β2组与对照眼0ng/ml TGF-β2组比较,实验眼TβR Ⅱ的阳性率明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。实验眼和对照眼SF细胞随着TGF-β2浓度的增高TβRⅡ的阳性率越来越高。经统计学分析SF细胞阳性率和TGF-β2浓度有明显的相关性。(P>0.05)。实验眼0ng/ml TGF-β2组与对照眼0ng/ml TGF-β2组比较,实验眼bFGF的阳性率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。实验眼和对照眼SF细胞随着TGF-β2浓度的增高bFGF的阳性率变化无明显统计学意义(P>0.05)。3流式细胞仪检测细胞生长周期结果：A、B、C三组实验眼后极部RPE细胞、SF细胞于诱导6天后,G0／G1期细胞百分比明显升高,S期百分比明显下降,15天时G0／G1期细胞百分比继续升高,S期百分比继续下降。但到30天时G0／G1期细胞百分比又有所降低,S期百分比又有所升高,与对照组相比差异仍有统计学意义(P<0.05)。A、B、C三组实验眼前部RPE细胞、SF细胞于诱导15天后,G0／G1期细胞百分比才开始明显升高,S期百分比明显降低,与对照眼相比差异有统计学意义(P<0.05),但到30天时G0／G1期细胞百分比又有所降低,S期百分比又有所升高,与对照眼相比差异仍有统计学意义(P<0.05)。A、B、C三组实验眼相同诱导时间前部RPE细胞、SF细胞与后极部RPE细胞、SF细胞比较,两者差异有统计学意义(P<0.05)。4细胞超微结构变化A、B、C三组实验眼后极部RPE细胞、SF细胞于诱导6天后,胞核外形不规则,胞质水中,胞浆内线粒体较多而小、部分线粒体水肿,粗面内质网扩张、内质网及核糖体等细胞器均减少,细胞界膜不清,部分界膜消失。A、B、C三组实验眼前部RPE细胞、SF细胞于诱导15天后,始见细胞核外形不规则,胞质水肿,胞浆内线粒体较多而小、部分线粒体水肿,粗面内质网扩张、内质网及核糖体等细胞器均减少,细胞界膜不清,部分界膜消失。5细胞力学研究结果(1)透镜诱导后巩膜成纤维细胞自身力学特性改变①不同诱导时间实验眼前部SF细胞力学特性比较及统计学分析实验眼前部SF细胞平衡杨氏模量、表观黏性6天组与15天组比较差异无统计学意义(P>0.05),30天组与6天组、15天组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。②不同诱导时间实验组后极部SF细胞力学特性比较及统计学分析实验眼后极部SF细胞平衡杨氏模量、表观黏性15天组与30天组比较差异无统计学意义(P>0.05),6天组与15天组、30天组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。③不同诱导时间自身对照眼前部及后极部SF细胞力学特性比较及统计学分析在诱导6天、15天、30天时,自身对照眼前部与后极部SF细胞平衡杨氏模量、表观黏性结果比较,差异无统计学意义(P>0.05)；两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。④各组实验眼的SF细胞力学特性与各组对照眼比较,论是平衡杨氏模量还是细胞表观黏性,实验眼前部于30天时与自身对照眼前部比较均增高,其差异有统计学意义(P<0.05)；实验眼后极部于15天、30天时与自身对照眼后极部比较均增高,其差异有统计学意义(P<0.05)。⑤经统计学分析：各诱导时间段自身对照眼巩膜细胞的杨氏模量、细胞表观黏性均与实验眼巩膜细胞的杨氏模量、细胞表观黏性有显著统计学差异(P<0.05)。(2)TGF-β2对SF细胞的力学特性变化的影响实验眼0ng/ml TGF-β2组与对照眼O ng/ml TGF-β2组比较,实验眼SF细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数明显升高,二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。实验眼与对照眼在TGF-β2作用下,0ng/ml组与1ng/ml组、10ng/ml组比较,细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数差异均有统计学意义(P<0.05)。实验眼和对照眼培养细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数与TGF-β2的质量浓度均呈正相关(r=0.743、r=0.533;r=0.654、r=0.576),实验眼和对照眼中的0ng/ml组与100ng/ml组比较,SF细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数差异均无统计学意义(P>0.05)。实验眼1ng/ml组、10ng/ml组与对照眼1ng/ml组、10ng/ml组比较,SF细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数之间差异有统计学意义(P<0.05)：实验眼100ng/ml组与对照眼100ng/ml组比较,SF细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1LIM模型可使RPE及SF细胞TGF-β2及MMP-2表达上调,并且表达水平存在时间和部位上的差异；同时使bFGF表达下调,但不存在明显的时间和部位上的差异。2LIM模型及TGF-β2刺激均可诱导RPE及SF细胞增殖抑制。3TGF-β2刺激可诱导RPE及SF细胞超微结构变化,同时上调MMP-2及TβRⅡ的表达,但对bFGF表达无明显作用。4LIM模型可使SF细胞平衡杨氏模量及粘弹性参数明显升高,产生“硬化”现象,且前部与后极部细胞发生变化的时间存在差异。5低浓度TGF-β2刺激可降低SF细胞的平衡杨氏模量及粘弹性参数。

全文目录

中文摘要  5-11
英文摘要  11-16
英文缩写  16-18
引言  18-19
第一部分豚鼠早期实验性近视眼视网膜色素上皮细胞的超微结构、生长周期与TGF-β2、bFGF表达变化  19-53
  前言  19
  材料与方法  19-27
  结果  27-31
  附图  31-39
  附表  39-46
  讨论  46-50
  小结  50-51
  参考文献  51-53
第二部分豚鼠早期实验性近视眼巩膜成纤维细胞的超微结构、增殖、MMP-2、TGF-β2、bFGF表达的变化  53-88
  前言  53
  材料与方法  53-56
  结果  56-60
  附图  60-70
  附表  70-80
  讨论  80-84
  小结  84-85
  参考文献  85-88
第三部分豚鼠实验性近视眼巩膜成纤维细胞力学特性的研究  88-106
  前言  88
  材料与方法  88-91
  结果  91-93
  附图  93-97
  附表  97-101
  讨论  101-104
  小结  104-105
  参考文献  105-106
第四部分 TGF-β2对豚鼠实验性近视眼后极部巩膜成纤维细胞的超微结构、增殖,MMP-2、TβRⅡ、bFGF表达的影响  106-135
  前言  106
  材料与方法  106-111
  结果  111-113
  附图  113-121
  附表  121-128
  讨论  128-131
  小结  131-132
  参考文献  132-135
第五部分 TGF-β2对实验性近视眼后极部巩膜成纤维细胞力学特性的影响  135-145
  前言  135
  材料与方法  135-137
  结果  137-138
  附图  138-140
  附表  140-141
  讨论  141-143
  小结  143-144
  参考文献  144-145
结论  145-146
综述视网膜色素上皮细胞与巩膜成纤维细胞在近视发病中的作用和研究进展  146-158
  参考文献  153-158
致谢  158-159
个人简历  159

豚鼠实验性近视眼巩膜成纤维细胞的力学特性变化及其与色素上皮细胞和部分细胞因子关系的研究

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