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旁分泌或自分泌细胞因子在乳腺癌上皮—间质转化（EMT）及耐药和转移中的作用

作　者: 郑国沛
导　师: 贺智敏
学　校: 中南大学
专　业: 基础医学
关键词: 乳腺癌化疗耐受上皮间质转化细胞因子肿瘤转移 miRNA 肿瘤干细胞
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景与目的乳腺癌是女性中发病率最高、危害最严重的恶性肿瘤之一。近年来,随着治疗手段的更新、治疗方案的改进及治疗方式的多样化,乳腺癌的临床治疗效果得到了很大改善,然而目前全世界每年仍有约50万人死于乳腺癌。长期研究表明：非手术治疗耐受和手术前后的转移是乳腺癌死亡的重要原因,乳腺癌治疗耐受与侵袭转移密切相关,如耐药乳腺癌更易发生远处转移,而转移的乳腺癌更具药物耐受性。但由于乳腺癌细胞和分子异质性明显,其非手术治疗耐受及早期微转移和晚期转移机制,尤其是耐受和转移之间的内在联系一直未予阐明。晚近较多的文献报道：乳腺癌发生发展和治疗过程中出现的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)与其细胞转移和耐药表型发生均存关联,较为一致的解释是,EMT后的细胞粘附能力降低、易自原发灶脱落,且易穿过血管壁而远处迁移；同时EMT过程使乳腺癌干细胞得以富集,继而增强细胞的药物抗性、凋亡抗性及转移能力。可见,乳腺癌EMT形成机制的阐述将可望阐述乳腺癌耐药、转移机制以及二者内在联系的规律。肿瘤细胞EMT启动与肿瘤微环境的改变相关,肿瘤细胞、肿瘤间质细胞、免疫细胞在肿瘤微环境变化时能自分泌或／和旁分泌一系列细胞因子来启动EMT进程,不幸的是手术、放化疗等均能引起微环境的改变,可见化疗、放疗在杀灭肿瘤细胞的同时也能诱导肿瘤细胞EMT及耐药和转移。为了探讨乳腺癌化疗耐药与转移的分子机制,一系列的细胞或动物模型相继建立,通过模型虽然鉴定了一系列的耐药或转移相关因子,但对这些因子的干预仍不能很好的解释或逆转肿瘤的耐药或转移现象。随着研究的深入,肿瘤微环境与肿瘤侵袭转移的关系己日益明确,而肿瘤微环境与肿瘤治疗反应或肿瘤耐药之间的关系研究报道仍然甚少。本课题组前期建立了乳腺癌5-Fu耐药细胞系MCF-7/5-Fu,发现该细胞系不仅耐药指数增高,还呈现典型的EMT形态特征；进一步基因表达谱芯片检测发现一系列EMT相关基因和细胞因子在耐药细胞(MCF-7/5-Fu)和亲代细胞(MCF-7)存在明显的差异表达。本课题将在验证EMT相关细胞因子TGFβ2在乳腺癌耐药中的作用和调节的基础上,重点探讨体外培养细胞微环境对肿瘤细胞EMT及耐药和转移的影响,筛选和鉴定参与调控的关键细胞因子,为阐述乳腺癌EMT及其在耐药和转移中的调控机制,乳腺癌耐药和转移的相互影响机制提供新的证据；为筛选和鉴定乳腺癌耐药和转移新的标志物,开发以标志物为靶点的可望干预和逆转乳腺癌耐药和转移的新药提供理论依据。方法(1)通过miRNA芯片筛选MCF-7/5-Fu细胞中的差异表达miRNAs并用miRNA特异性qRT-PCR验证,结合生物信息学分析对接前期差异基因芯片结果以预测可能靶向调控TGFβ2的miRNAs;在8株乳腺癌细胞系中验证miRNAs与TGFβ2的相关关系；将两个Copy miRNA前体克隆入pLEX-MCS慢病毒载体分别构建miR-141、 miR-200a和miR-145过表达的慢病毒表达系统,用经293T细胞包装后的病毒颗粒感染TGFβ2高表达而相应miRNAs低表达的MCF-7/5-Fu、MDA-MB-231和Hs578T细胞,观察各miRNA单独或联合过表达对TGFβ2表达的影响；将TGFβ2-3’UTR区上单个或多个miRNA结合位点克隆入pMir-Report报告基因载体,进一步观察miRNA单独或联合作用对TGFβ2的直接靶向作用,并评估miR-141、 miR-200a和miR-145靶向TGFβ2表达的协同作用。(2) qRT-PCR和ELISA实验检测各乳腺癌细胞中TGFβ2的表达及分泌情况,用TGFβ2重组蛋白诱导内源性低表达TGFβ2的上皮型乳腺癌细胞MCF-7、T47D、BT474、SKBR3和MDA-MB-453,用TGFβ受体抑制剂SD208和SB525334处理或用pLEX-miRNAs慢病毒颗粒感染内源性高表达TGFβ2的间质型乳腺癌细胞MCF-7/5-Fu、 MDA-MB-231和Hs578T,观察各处理前后细胞的形态,MTS实验检测各细胞的药物敏感性、qRT-PCR和western blot检测EMT标志物及其他相关分子、transwell实验检测细胞侵袭能力、微球体培养及流式细胞术检测乳腺癌干细胞CD44+CD24-/low细胞亚群比例的变化。(3)检测TGFβ2重组蛋白诱导MCF-7或TGFβ受体抑制SD208和SB525334处理MDA-MB-231和Hs578T细胞后miR-141、miR-200a和miR-145的表达变化；用sh-RNA表达载体pRNAT-U6.1/sh-snail1转染MCF-7、MDA-MB-231和Hs578T细胞建立稳定Snail1knockdown细胞系,再用TGFβ2或SD208和SB525334处理后检测各细胞中miR-141、 miR-200a和]miR-145的表达情况；将miR-141、miR-200a和miR-145前体上游2000bp的DNA片段克隆入pGL4-Luc报告基因载体,用双荧光素酶报告基因实验验证miR-141、miR-200a和miR-145的可能启动子,生物信息分析Snail1与miRNAs启动子的结合情况并以MDA-MB-231细胞为模型用CHIP实验检测两者的结合情况；用GSK3β过表达载体pLV-Ubc-GSK3β转染或DKK1重组蛋白处理MDA-MB-231和Hs578T田胞后,检测rniR-141、miR-200a和miR-145的表达情况。(4)收集耐药细胞MCF-7/5-Fu的培养上清液,用收集的上清液培养上皮型乳腺癌细胞T47D、BT474、SKBR3和MDA-MB-453细胞,观察各细胞的形态学变化；MTS试验检测各细胞的药物敏感性；qRT-PCR、Western blot及免疫荧光检测EMT标志物的表达；Transwell实验评估细胞侵袭能力；微球体形成实验和流式细胞术分析CD44+CD24-/loW干细胞亚群来检测各细胞中乳腺癌干细胞的比例。(5)通过细胞因子芯片筛选耐药细胞MCF-7/5-Fu和亲本MCF-7细胞培养上清液中的差异表达细胞因子,用qRT-PCR和ELISA实验验证相关细胞因子在各乳腺癌细胞中的表达,用TNFα、NOV、FGF2和IL-6(称为cytokines cocktail)单独或联合诱导MCF-7、T47D、 BT474、SKBR3和MDA-MB-453上皮型乳腺癌细胞,观察诱导前后各细胞的形态,MTS实验检测处理前后各细胞的药物敏感性、qRT-PCR和Western blot检测EMT标志物表达变化、transwell检测细胞侵袭能力及流式细胞术检测乳腺癌干细胞比例的变化,双荧光素酶报告基因实验结合western blot检测cytokines cocktail处理后NF-κB、wnt/β-cateni、Hedgehog、MAPK/ERK和p38MAPK等多条信号通路的活化情况,并观察信号通路抑制剂NF-κB抑制剂Bay11-7082、Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK1、ERK抑制剂PD98059、p38抑制剂SB203580处理对EMT表型的逆转情况。结果(1) miRNA芯片筛选出35个差异表达miRNAs,通过生物信息学分析MCF-7/5-Fu中低表达的miR-141、miR-200a和miR-145可能靶向TGFβ2; TGFβ2在MCF-7/5-Fu和间质型乳腺癌细胞MDA-MB-231和Hs578T细胞中的mRNA表达及蛋白分泌明显高于上皮型乳腺癌细胞,而相应的miR-141、miR-200a和miR-145的表达明显较低；含两个Copy miRNA前体的慢病毒表达系统明显上调MCF-7/5-Fu、MDA-MB-231和Hs578T细胞中miR-141、miR-200a和miR-145的表达,miR-141、miR-200a和miR-145能直接靶向调控TGFβ2的表达且miRNAs间呈现协同作用；在MCF-7细胞中低剂量TGFβ2能以Snail1依赖性上调miR-141、miR-200a和miR-145的表达,而TGFβ受体抑制剂、干扰Snail1表达、外源性过表达GSK3β或DKK1处理明显上调MDA-MB-231和Hs578T中miR-141/200a和miR-145的表达；Snail1能直接与miR-141、miR-200a和miR-145启动子结合在转录水平抑制miRNAs的表达,而GSK3P能逆转Snail1对miRNAs的转录抑制作用。(2) TGFβ受体抑制剂或miR-141、miR-200a和miR-145过表达以抑制TGFβ2的表达仅能部分逆转MCF-7/5-Fu细胞的EMT表型；而能明显逆转MDA-MB-231和Hs578T细胞的间质表型和耐药表型,同时,抑制MDA-MB-231和Hs578T的侵袭能力、干细胞微球体形成能力和乳腺癌干细胞比例。在所选的上皮型乳腺癌细胞中,长期TGFβ2仅能诱导MCF-7和MDA-MB-453细胞发生部分EMT变化,有限程度地增加耐药性、侵袭能力和乳腺癌干细胞比例。(3) MCF-7/5-Fu耐药细胞的培养上清液能诱导MCF-7、T47D、 BT474.SKBR3和MDA-MB-453等上皮型乳腺癌细胞形成典型EMT表型,细胞变得狭长,细胞之间疏散,呈现间质细胞样的表型改变,上皮标志物表达下调,间质标志物表达上调,对5-Fu的耐药性增加、细胞增殖速度加快、侵袭能力增强、微球体形成的数量增加且体积增大、乳腺癌干细胞比例增加,暂称这些诱导而来的细胞为“二代耐药细胞”,以XX/media表达,如MCF-7/media。(4)通过细胞因子芯片筛选,qRT-PCR和ELISA验证,发现TGFβ2、TNFα、NOV、CXCL10、FGF2和IL-6等细胞因子在MCF-7/5-Fu及除TGFβ2外在XX/media细胞中的表达或培养上清中的含量明显上调,单一的细胞因子难以诱导MCF-7细胞发生EMT,其中CXCL10上调E-cadherin的表达。TNFα、NOV、FGF2和IL-6联合应用(称为cytokines cocktail)诱导MCF-7、T47D、BT474、SKBR3和MDA-MB-453细胞形成明显的EMT表型(细胞暂命名：XX/cocktail,如MCF-7/cocktail),引起EMT相关分子的变化,增加了细胞耐药性、侵袭能力和乳腺癌干细胞比例。cytokines cocktail能活化细胞内NF-κB、Wnt/β-catenin、Hedgehog、MAPK/ERK和p38MAPK等多条信号通路,NF-κB抑制剂Bay11-7082、Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK1、ERK抑制剂PD98059、p38抑制剂SB203580联合应用能明显逆转MCF-7/cocktail细胞、MCF-7/5-Fu和MCF-7/media细胞的EMT表型及EMT标志物的表达。结论(1) TGFβ2/Snail1/miRNAs形成的负反馈调控环路维持间质型乳腺癌细胞TGFP2的高表达和miR-141、miR-200a和miR-145的低表达状态。(2) GSK3β或DKK1能逆转Snail1对miR-141、miR-200a和miR-145的转录抑制作用。(3) TGFβ2在维持乳腺癌细胞EMT表型具有细胞依赖性,抑制TGFβ信号能明显逆转对TGFβ2有依赖性的先天性间质型乳腺癌细胞的间质表型,而仅能部分逆转化疗诱导的获得性耐药乳腺癌细胞的EMT表型。(4) MCF-7/5-Fu细胞的培养上清液能诱导上皮型乳腺癌细胞发生EMT,首次发现己获得耐药表型乳腺癌细胞对原发乳腺癌细胞的影响。(5)细胞因子TNFα、NOV、FGF2和IL-6可能在维持乳腺癌获得性耐药细胞的EMT表型中起着关键作用, cytokines cocktail能诱导不同遗传背景的上皮型乳腺癌细胞发生明显的EMT表型,NF-κB、 Wnt/β-catenin、Hedgehog、MAPK/ERK和p38MAPK等信号通路介导了cytokines cocktail对乳腺癌细胞的EMT诱导作用,提示化疗诱导乳腺癌耐药和EMT是多条信号通路共同参与的结果。

全文目录

摘要  5-11
Abstract  11-17
目录  17-18
前言  18-25
第一部分 TGF B2对话MICRORNAS在EMT介导的乳腺癌耐药和转移中的作用  25-80
  1.1 引言  25-26
  1.2 材料与方法  26-46
  1.3 实验结果  46-77
  1.4 讨论  77-80
第二部分旁分泌或自分泌细胞因子对乳腺癌EMT及耐药和转移的诱导作用  80-98
  2.1 引言  80-81
  2.2 材料与方法  81-83
  2.3 实验结果  83-96
  2.4 讨论  96-98
第三部分诱导和维持乳腺癌EMT及耐药转移相关细胞因子的筛选和鉴定  98-121
  3.1 引言  98
  3.2 材料与方法  98-103
  3.3 实验结果  103-118
  3.4 讨论  118-121
结论  121-122
参考文献  122-132
综述  132-147
  参考文献  139-147
读博期间发表的学术论文  147-149
致谢  149

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