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金龙胶囊对人胰腺癌细胞BXPC-3增殖和凋亡的影响

作　者: 李要远
导　师: 贺用和
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 金龙胶囊人胰腺癌细胞BXPC-3 增殖凋亡
分类号: R735.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：胰腺癌是一种重要的内脏实体瘤,迄今为止无论在早期诊断上还是在治疗上都是最难的恶性肿瘤之一。临床实践证明,对于胰腺癌的治疗,单纯的手术治疗效果是有限的,而目前用于胰腺癌的放化疗治疗及靶向治疗手段的效果也不佳。因此,使胰腺癌成为发病率和致死率基本相等的恶性肿瘤之一。故已有不少学者将胰腺癌称为“21世纪的癌中之王”。为了提高胰腺癌患者的生存率,研究开发新的内科药物的任务迫切。金龙胶囊(JLC)作为中药制剂,主要由鲜白花蛇、鲜蕲蛇、鲜守宫等药物组成,在其鲜活的状态下经“低温冷冻现代生化分离提取工艺”制备。既往相关实验数据证明了其在抗肿瘤作用中的多靶点性,但JLC对胰腺癌作用的相关基础研究还未见报道。本实验通过研究JLC对人胰腺癌细胞BXPC-3增殖和凋亡的影响,探明其可能的作用机制,为JLC治疗胰腺癌提供一定的理论支持,也为下一步深入研究做好铺垫。方法：1MTT比色法测定不同浓度JLC作用于人胰腺癌细胞BXPC-324h.48h.72h.96h、120h后,对其增殖的抑制率。同时探求合适的作用时间和剂量,应用于后续实验。2运用AV-FITC/PI对JLC作用48h后的人胰腺癌细胞BXPC-3进行染色,激光共聚焦显微镜观察细胞形态的变化。3AV-FITC/PI双染法流式细胞术检测不同浓度JLC作用于人胰腺癌细胞BXPC-348h后细胞凋亡的情况。4PI单染法流式细胞术检测不同浓度JLC作用于人胰腺癌细胞BXPC-348h后细胞周期的变化。5ELISA(?)检测不同浓度JLC作用于人胰腺癌细胞BXPC-348h后,细胞基质中钙结合蛋白S100A4的表达。6蛋白质免疫印迹法Western Blotting测定不同浓度JLC作用人胰腺癌细胞BXPC-348h后,人胰腺癌细胞BXPC-3中BNIP3.Bcl-2及Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达水结果：1MTT比色法检测结果显示JLC具有良好的抑制人胰腺癌细胞BXPC-3增殖的作用。JLC作用于人胰腺癌细胞BXPC-3细胞48h后,浓度为0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的JLC组与阴性对照组相比,差异显著；浓度为0.8mg/ml的JLC组与阳性药物吉西他滨(GEM)组相比差异不显著,浓度为1.0mg/ml的JLC组对细胞增殖的抑制作用优于阳性对照组。并且培养液作用48h时,细胞代谢产物相对较少,对结果干扰较小。综合以上两因素,后续实验选用JLC的浓度为0.4、0.6、0.8mg/ml,作用时间为48h。2用AV-FITC/PI双染0.8mg/ml浓度的JLC作用后的人胰腺癌细胞BXPC-3,激光共聚焦显微镜观察显示早期凋亡细胞AV-FITC绿色荧光增强,凋亡晚期AV-FITC绿色、PI红色荧光均增强,坏死细胞则只有PI荧光增强。凋亡及坏亡细胞的细胞核及整个细胞形态不规则、大小不等。3AV-FITC/PI双染流式细胞术检测显示JLC在0.4、0.6、0.8mg/ml浓度下,作用于人胰腺癌细胞BXPC-348h后,可以明显促进细胞的凋亡,且具有明显的剂量依赖性,随着JLC浓度的升高,晚期凋亡细胞增多更明显。4PI单染流式细胞术检测显示JLC在0.4、0.6、0.8mg/ml浓度下,作用于人胰腺癌细胞BXPC-348h后,细胞周期G2/M及S期明显增加,G1/G0减少,在0.6mg/ml浓度时最明显。5ELISA法检测显示JLC在0.4、0.6、0.8mg/ml浓度下,作用于人胰腺癌细胞BXPC-348h后,其细胞基质中所含钙结合蛋白S100A4的浓度分别为17.982、17.907、16.782pg/ml,与正常组19.789pg/ml的浓度有差异。6Western Blotting检测显示JLC在0.4、0.6、0.8mg/ml浓度下,作用于人胰腺癌细胞BXPC-348h后,Caspase-3蛋白在各组细胞中表达差异不明显,而BNIP3、Bcl-2蛋白的表达在各组中差异明显。与正常组相比较,JLC组中BNIP3蛋白表达增多,而Bcl-2蛋白则表达减少。结论：JLC能明显抑制人胰腺癌细胞BXPC-3的增殖,促进人胰腺癌细胞BXPC-3的凋亡。可能通过促进细胞凋亡；阻滞细胞周期于S、G2/M期,影响细胞周期的正常转化；降低钙结合蛋白S100A4等途径抑制细胞增殖。促进凋亡的作用机制可能与调高了促凋亡蛋白BNIP3,降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
英文縮略语  9-10
第一部分综述部分  10-22
  综述一金龙胶囊抗肿瘤基础研究进展  10-14
    参考文献  13-14
  综述二胰腺癌中西医内科治疗研究进展  14-22
    参考文献  20-22
第二部分实验部分  22-59
  前言  22-24
  实验一细胞培养  24-26
  实验二 MTT实验检测JLC对人胰腺癌细胞BXPC-3增殖的影响  26-32
  实验三激光共聚焦显微镜观察JLC对人胰腺癌细胞BXPC-3凋亡的形态学影响  32-35
  实验四 AV-FITC/PI双染流式细胞术检测JLC对人胰腺癌细胞BXPC-3凋亡的影响  35-39
  实验五 PI单染流式细胞术检测JLC对人胰腺癌细胞BXPC-3细胞周期的影响  39-44
  实验六 ELISA法检测JLC对人胰腺癌细胞BXPC-3中S100A4蛋白表达的影响  44-48
  实验七 Western Blotting法检测凋亡相关蛋白  48-58
  参考文献  58-59
致谢  59-60
个人简历  60

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