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TrkB/BDNF信号通路与FOXM1在多发性骨髓瘤中相互关系的初步研究

作　者: 毛霞
导　师: 张东华
学　校: 华中科技大学
专　业: 血液内科
关键词: TrkB FOXM1 多发性骨髓瘤 K252a Thiostrepton PI3K/AKT Raf/MEK/MAPK mTOR FOXO3a
分类号: R733.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

[目的]本研究旨在探讨TrkB/BDNF与FOXM1分子在多发性骨髓瘤患者和健康对照的骨髓单个核细胞的表达差异,并用免疫组化法检测多发性骨髓瘤患者及健康对照患者骨髓涂片中TrkB与FOXM1蛋白的表达差异,以明确TrkB与FOXM1分子在多发性骨髓瘤患者的表达状态。[方法]收集我院初诊的多发性骨髓瘤患者、完全缓解多发性骨髓瘤患者及健康对照的骨髓涂片及骨髓标本。将骨髓标本分离单个核细胞,用普通PCR方法(RT-PCR)检测TrkB与FOXM1基因在多发性骨髓瘤患者和健康对照的骨髓单个核细胞的表达差异,并采用更为敏感的Real time PCR (RQ-PCR)技术进一步检测多发性骨髓瘤患者各标本之间与健康对照之间、同一患者治疗前与完全缓解后TrkB与FOXM1基因的表达差异。此外,用免疫组化法检测多发性骨髓瘤患者及健康对照患者的骨髓涂片中TrkB与FOXM1蛋白的表达差异。[结果]普通PCR方法检测了50例初诊的多发性骨髓瘤患者,其中有48例TrkB表达阳性,40例FOXM1表达阳性；免疫组化结果显示骨髓涂片18例MM患者有17例瘤细胞TrkB阳性表达(94%),14例FOXM1阳性表达(77%)；而7例对照组正常造血细胞仅有2例和3例弱阳性表达；Real time PCR (RQ-PCR(?)结果显示多发性骨髓瘤患者TrkB与FOXM1mRNA表达水平完全缓解后较治疗前均明显下降。4例长期随访患者可见TrkB与FOXM1持续高表达或下降后又上升的患者呈现复发,提示TrkB与FOXM1的表达与多发性骨髓瘤的疾病进展有关。[结论]多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞存在着TrkB与FOXM1的高表达,TrkB与FOXM1的表达与多发性骨髓瘤的疾病进展有关。[目的]用TrkB抑制剂K252a处理人多发性骨髓瘤细胞系8226,检测FOXM1及其下游靶基因的表达改变及其相关性；研究TrkB抑制剂K252a及FOXM1抑制剂硫链丝菌素(Thiostrepton)对人多发性骨髓瘤细胞系8226细胞凋亡、细胞周期、增殖等生物学行为的影响,从而进一步研究FOXM1与TRKB/BDNF信号通路是否有相关性。[方法]1.用TrkB抑制剂K252a处理多发性骨髓瘤细胞系8226,分别设置K252a作用细胞的时间梯度(0h、12h、24h、48h)和浓度梯度(K252a0nm、100nm、200nm、400nm),然后用RQ-PCR方法检测FOXM1及其下游靶基因CyclinB1和CDC25B的mRNA水平表达情况,以检测FOXM1及其下游靶基因的mRNA水平改变与K252a作用有无关联；2.进一步用TrkB抑制剂K252a处理多发性骨髓瘤细胞系8226,分别设置K252a作用细胞的时间梯度(0h、12h、24h、48h)和浓度梯度(K252a0nm、100nm、200nm、400nm),然后用Western Blot方法检测FOXM1及其下游靶基因CyclinB1和CDC25B的蛋白水平表达情况；3.将多发性骨髓瘤细胞系8226用含1%的胎牛血清培养基饥饿处理4小时后,对8226细胞处理进行以下分组：(1)BDNF组(50ng/ml),(2) Thiostrepton组(5μM),(3) BDNF (50ng/ml)+Thiostrepton(5μM)组,(4)BDNF(50ng/ml)+Thiostrepton (5μM)+LY294002(50μM)组,24h后收获细胞,分别用Annexin V-PI双染法,通过流式细胞术检测细胞凋亡情况；4.分别用TrkB抑制剂K252a (K252a浓度梯度：Onm、100nm、200nm、400nm)和FOXM1抑制剂Thiostrepton (Thiostrepton浓度梯度：0μM、5μM、10μM、20μM)处理多发性骨髓瘤细胞系8226,于24h和48h分别用PI染色流式检测细胞周期改变；5.抑制剂K252a (0、50、100、200、400nm)和Thiostrepton(0、2.5、5、10、20、μM)分别作用和K252a+Thiostrepton(空白、K252a50nm+Thiostrepton2.5μM、K252a100nm+Thiostrepton5μM、K252a200nm+Thiostrepton10μM、 K252a400nm+Thiostrepton20μM)共同作用于8226细胞,48h后用CFSE标记染色,流式检测细胞增殖能力改变。[结果]1. TrkB抑制剂K252a处理人多发性骨髓瘤细胞系8226后,FOXM1及其下游靶基因CyclinB1和CDC25B的mRNA表达水平及蛋白水平均呈剂量依赖性和时间依赖性下调；2. FOXM1抑制剂Thiostrepton处理8226细胞24h后,细胞凋亡率较空白对照组有明显上升；但加入BDNF与Thiostrepton共同作用后,细胞凋亡率稍有下降；最后将PI3K/AKT抑制剂LY294002与BDNF和Thiostrepton同时作用细胞后细胞凋亡率又出现增加；3.K252a作用于8226细胞24h和48h后,100nmol组将8226细胞明显阻断于G0/G1期,导致S期数量下降,对S期向G2/M期进展无明显影响,而200nmol组和400nm组可见G2/M期细胞比例明显升高,S期明显降低,G0/G1期细胞比例降低；可见k252a作用多发性骨髓瘤8226细胞系后低浓度出现G0/G1期阻滞,高浓度细胞出现G2/M期阻滞。Thiostrepton作用于8226细胞24h和48h后,G0/G1期细胞比例降低,S期明显降低,G2/M期明显升高,可见FOXM1抑制剂硫链丝菌素Thiostrepton作用多发性骨髓瘤8226细胞系后细胞出现G2/M期阻滞,与K252a高浓度作用8226细胞后周期改变一致。4.抑制剂K252a和Thiostrepton作用8226细胞48h后,各组8226细胞随浓度梯度增殖作用明显下调,二者共同作用后对肿瘤细胞的生长有进一步抑制作用。[结论]TrkB抑制剂K252a对8226细胞的FOXM1及其下游靶基因CyclinB1和CDC25B的mRNA水平和蛋白水平均有下调作用,说明FOXM1可能是TRKB/BDNF信号通路下游靶基因；BDNF能挽救一部分Thiostrepton抑制剂诱导的8226细胞凋亡,并且这种凋亡与PI3K/AKT信号通路有关；k252a对多发性骨髓瘤8226细胞系周期与增殖的影响可能与FOXM1有关。TrkB/BDNF信号通路及FOXM1对8226细胞的凋亡、周期和增殖能力均有影响,可能成为抗多发性骨髓瘤治疗的靶点。[目的]本研究旨在通过使用不同激酶抑制剂与BDNF相互作用后,检测相关信号通路靶分子及FOXM1的改变情况,以明确TrkB/BDNF信号通路调控FOXM1的机制。[方法]1.用TrkB抑制剂K252a处理多发性骨髓瘤细胞系8226,分别设置K252a浓度梯度(K252a0nm、100nm、200nm、400nm),然后用Western Blot方法检测,相关靶基因TrkB、p-TrkB、Akt、 p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a、 MAPK及p-MAPK的蛋白水平改变；2.进一步用P13K抑制剂LY294002、 FRAP/mTOR抑制剂Rapamycin和MAPKK抑制剂PD98059等不同的激酶抑制剂与BDNF作用于8226细胞24小时候,Western blot检测不同的处理组FOXM1的蛋白表达改变情况；3.分别用不同浓度TrkB抑制剂K252a、FRAP/mTOR抑制剂Rapamycin和FOXM1抑制剂Thiostrepton处理多发性骨髓瘤细胞系822624小时,收集细胞RQ-PCR方法检测FOXM1、mTOR及TrkB的mRNA水平表达情况;[结果]1.用TrkB抑制剂K252a处理8226细胞后,TrkB总蛋白未出现明显变化,但TrkB的磷酸化水平随作用时间的延长而降低；FOXM1及下游靶基因CyclinB1、CDC25B蛋白表达下降的同时,还伴随着Akt、FOXO3a、MAPK的磷酸化水平相应降低;2.P13K抑制剂LY294002、FRAP/mTOR抑制剂Rapamycin和MAPKK抑制剂PD98059均能抑制FOXM1的表达,但以P13K抑制剂LY294002的抑制作用最明显；TrkB的配体BDNF作用于8226细胞后,FOXM1的表达稍有增加；当BDNF与不同的激酶抑制剂共同作用时,FOXM1的表达均出现下调,BDNF诱导的FOXM1表达增加被阻断。3.不同浓度K252a与Rapamycin分别作用细胞后,mTOR及FOXM1基因的mRNA表达水平均随浓度梯度增加依次下调,两基因的mRNA水平表达呈正相关性；Thiostrepton处理多发性骨髓瘤细胞系822624小时,FOXM1的表达水平随药物浓度的增加而下调,TrkB基因的mRNA表达水平则随浓度梯度增加依次上调,与FOXM1的改变趋势相反,mTOR的变化不是很明显,仅在高浓度作用时稍有上调。[结论]以上实验结果表明FOXM1的表达受PI3K/AKT、MAPK两条信号通路共同影响,BDNF能诱导FOXM1的表达增加,且这种作用可被P13K抑制剂、FRAP/mTOR抑制剂和MAPKK抑制剂阻断,推测TrkB/BDNF信号通路可能主要通过PI3K/AKT. Raf/MEK/MAPK信号通路调控FOXM1的表达,还与mTOR和FOXO3a分子密切相关。

全文目录

英文缩略词表  6-9
第一部分 TrkB/BDNF与FOXMl分子在多发性骨髓瘤的表达  9-29
  摘要  9-10
  Abstract  10-11
  前言  11-13
  材料与方法  13-21
  实验结果  21-23
  讨论  23-26
  参考文献  26-29
第二部分 TrkB/BDNF信号通路及FOXMl对HMCL8226生物学行为的影响  29-57
  摘要  29-32
  Abstract  32-34
  前言  34-35
  材料与方法  35-46
  实验结果  46-52
  讨论  52-55
  参考文献  55-57
第三部分 TrkB/BDNF信号通路调控FOXM1的机制研究  57-82
  摘要  57-59
  Abstract  59-61
  前言  61-62
  材料与方法  62-69
  实验结果  69-73
  讨论  73-78
  参考文献  78-82
全文总结  82-84
本研究的创新点与特色  84-85
本研究的不足之处与展望  85-86
综述 Trk信号转导通路在肿瘤中的研究进展  86-100
  参考文献  94-100
附录攻读学位期间发表论文情况  100-101
致谢  101-102

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 骨髓肿瘤
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