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通过母体血浆无创性检测胎儿RhCcE血型的研究

作　者: 李玲
导　师: 姚余有; 刘忠
学　校: 安徽医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 荧光定量PCR 胎儿DNA RhCcE血型产前诊断
分类号: R714.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景：母婴Rh血型不合是引起胎儿和新生儿溶血病(HDFN)的主要原因之一。产前预测胎儿血型是预防和治疗HDFN的主要手段。目前,常规的产前诊断方法一般是通过羊水穿刺、绒毛膜穿刺术等侵入性的方法获得标本,有引起自然流产的风险。因此,从母亲外周血中检测胎儿血型的非侵入性方法对优生优育有着重要意义。目的：建立荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法从母体血浆中检测胎儿RhCcE血型,优化并验证此方法在不同孕期通过母体血浆检测胎儿RhCcE血型的准确性。方法：随机采集孕8-38周的妇女外周血,提取游离DNA,用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法检测胎儿的RhCcE血型,利用胎儿脐带血标本检测的结果进行验证。结果：1.本研究结果中,成功的建立了从母体外周血中检测胎儿RhCcE血型的荧光定量PCR检测方法；2.该方法检测RhC、c、E的准确率分别为94%、100%、100%；特异性分别为100%、100%、100%；敏感性分别为83%、100%、100%。3.该方法在孕8-12周、13-20周、21-38周检测的准确率如下：C基因型分别为94.1%、91.6%、100%,漏检率为5.9%、8.3%、0%(漏检绝对数之比分别是1/17、2/24、0/18)；c基因型分别为97.6%、100%、100%,漏检率为2.4%、0%、0%(漏检绝对数之比分别是1/42、0/55、0/30)；E基因型分别为97.8%、98.4%、100%,漏检率为2.1%、1.6%、0%(漏检绝对数之比分别是1/47、1/61、0/35)；4. QIAamp DNA Blood Midi Kit的提取效果优于QIAamp DNA Blood Mini Kit。结论：FQ-PCR检测方法能够在孕早期检测出胎儿RhCcE血型,可以用于胎儿和新生儿溶血病的产前诊断,其准确性随着孕期的增加而增加,母体血浆中提取游离DNA的方法是影响检测灵敏度的重要因素。

全文目录

目录  4-7
英文缩略词表  7-8
中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 引言  11-17
  1.1 Rh血型系统  11-12
  1.2 怀孕期间母亲和胎儿之间的血液交换  12
  1.3 胎儿和新生儿溶血病  12-13
  1.4 胎儿和新生儿溶血病的预防  13-14
  1.5 胎儿Rh血型的产前基因分型  14
  1.6 产前胎儿血型的检测  14-15
  1.7 母体血浆中的胎儿DNA  15-17
2 材料与方法  17-26
  2.1 荧光定量PCR检测方法的建立  17-22
    2.1.1 标本来源  17
    2.1.2 实验仪器  17-18
    2.1.3 实验试剂  18
    2.1.4 实验耗材  18-19
    2.1.5 方法  19-22
      2.1.5.1 标本处理  19
      2.1.5.2 母亲RhCcE血型的检测  19
      2.1.5.3 母体血浆中游离DNA的提取  19-20
      2.1.5.4 DNA浓度测定  20
      2.1.5.5 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)实验  20-22
        2.1.5.5.1 引物和探针的设计与合成  20-21
        2.1.5.5.2 引物、探针的溶解与分装  21
        2.1.5.5.3 配置FQ-PCR主要反应液  21-22
        2.1.5.5.4 FQ-PCR扩增条件  22
        2.1.5.5.5 FQ-PCR实验结果的判定  22
      2.1.5.6 FQ-PCR实验检测结果准确性的验证  22
    2.1.6 统计分析  22
  2.2 DNA提取方法的优化  22-24
    2.2.1 标本来源  23
    2.2.2 实验仪器  23
    2.2.3 实验试剂  23
    2.2.4 实验耗材  23
    2.2.5 方法  23-24
      2.2.5.1 游离DNA的提取  23-24
        2.2.5.1.1 采用QIAamp DNA Mini kit从母体血浆中提取胎儿DNA  23
        2.2.5.1.2 采用QIAamp DNA Midi kit从母体血浆中提取胎儿DNA  23-24
      2.2.5.2 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)实验  24
    2.2.6 统计分析  24
  2.3 验证FQ-PCR检测方法在不同孕期检测胎儿RhCcE血型的准确性  24-26
    2.3.1 标本来源  24
    2.3.2 实验仪器  24
    2.3.3 实验试剂  24
    2.3.4 实验耗材  24
    2.3.5 方法  24-25
      2.3.5.1 标本处理  24-25
      2.3.5.2 母亲RhCcE血型的检测  25
      2.3.5.3 游离DNA的提取  25
      2.3.5.4 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)实验  25
      2.3.5.5 FQ-PCR实验结果准确性的验证  25
    2.3.6 统计分析  25-26
3 结果  26-33
  3.1 荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法的建立  26-29
    3.1.1 母亲RhCcE血型的血清学检测结果  26
    3.1.2 DNA浓度测定结果  26-27
    3.1.3 扩增曲线  27-28
    3.1.4 FQ-PCR法检测结果的验证  28-29
  3.2 DNA提取方法的优化  29-30
    3.2.1 用FQ-PCR法检测RhC血型  29
    3.2.2 统计分析  29-30
  3.3 验证FQ-PCR检测方法在不同孕期检测胎儿RhCcE血型的准确性  30-33
    3.3.1 RhCcE血型的血清学检测结果  30
    3.3.2 不同孕期各血型的FQ-PCR检测结果的验证  30-32
    3.3.3 统计分析  32-33
4 讨论  33-37
5 结论  37
参考文献  37-43
本人简历  43-44
致谢  44-45
综述  45-51
  参考文献  49-51

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