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腺病毒介导的GDF-5促进退行性变椎间盘髓核细胞外基质表达的实验研究

作　者: 罗栩伟
导　师: 冯刚
学　校: 川北医学院
专　业: 内科学
关键词: 椎间盘退行性变 生长分化因子-5 髓核 腺病毒 基因治疗
分类号: R681.53
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 22次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


目的：构建携带人生长分化因子-5（growth and differentiation factor-5,GDF-5）基因的重组腺病毒，研究腺病毒介导的GDF-5对人退行性变椎间盘髓核细胞外基质表达的影响，探索椎间盘退行性变（intervertebral discdegeneration, IDD）基因治疗的新途径。方法：（1）利用AdEasy-1腺病毒载体系统构建Ad-GDF-5重组腺病毒载体，经Hind III酶切、基因测序鉴定后转染HEK293细胞对病毒进行包装、扩增、纯化，分别采用Western Blotting、TCID50方法对Ad-GDF-5进行病毒鉴定和滴度测定。（2）收集人退变椎间盘髓核组织，体外分离培养髓核细胞，以最佳感染复数的Ad-GDF-5感染人髓核细胞，分别设为空白对照组（Control组）、阴性对照组（GFP组）、实验组（GDF-5组）三个组，3d、7d、14d、21d四个时间点。（3）二甲基亚甲蓝显色法、Hoechst33258荧光染色法分别检测三组髓核细胞sGAG、DNA的含量，单因素方差分析sGAG/DNA比值的差异性。（4）氯胺T染色法检测三组髓核细胞中羟脯氨基酸的含量，单因素方差分析羟脯氨基酸含量的差异性。（5）髓核细胞免疫荧光染色观察蛋白多糖的表达，免疫组化染色观察Ⅱ型胶原的表达。（6）Safranine-O染色分析Ad-GDF-5对髓核细胞硫酸化糖胺聚糖含量的影响。（7）通过实时荧光定量聚合酶链式反应（real-timequantitative polymerase chain reaction）检测三组髓核细胞中Aggrecan、CollagenⅡmRNA的表达水平。结果：（1）经限制性内切酶检测、基因测序和Western Blotting蛋白鉴定证实成功地构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体并制备出5.6×10~9PFU/ml的高滴度重组腺病毒。（2）髓核细胞sGAG含量随时间逐步增加，但在3d和7d时三组间sGAG含量比较均无统计学差异（P>0.05）。在14d时GDF-5组sGAG含量较Control组和GFP组明显增加，有显著性差异（P<0.05）；在21d时GDF-5组sGAG含量显著高于Control组和GFP组，有非常显著的差异（P<0.01）；但在14d和21d时Control组与GFP组sGAG含量比较均无统计学差异（P>0.05）。（3）羟脯氨基酸含量在3d时三组间比较均无统计学差异（P>0.05）；但在7d时GDF-5组羟脯氨基酸含量较Control组和GFP组明显增加，有显著性差异（P<0.05）；在14d和21d时GDF-5组羟脯氨基酸含量显著高于Control组和GFP组，有非常显著的差异（P<0.01）。然而任意时间点，Control组与GFP组羟脯氨基酸含量比较均无统计学差异（P>0.05）。（4）髓核细胞免疫荧光染色、免疫组化染色、Safranine-O染色显示在感染重组病毒后3d和7d时，三组髓核细胞的蛋白多糖、Ⅱ型胶原、硫酸化糖胺聚糖均呈弱阳性染色；在14d时GDF-5组蛋白多糖、Ⅱ型胶原、硫酸化糖胺聚糖阳性染色均有所增强；在21d时GDF-5组蛋白多糖、Ⅱ型胶原、硫酸化糖胺聚糖均呈强阳性染色；而在14d和21d时Control组和GFP组仍呈弱阳性染色。（5）Aggrecan、CollagenⅡ两基因的表达在3d和7d时三组间比较均无统计学差异（P>0.05）；但在14d时GDF-5组Aggrecan、CollagenⅡ两基因的表达较Control组和GFP组明显增加，有显著性差异（P<0.05）；在21d时GDF-5组Aggrecan、CollagenⅡ两基因的表达显著高于Control组和GFP组，有非常显著的差异（P<0.01）。然而在14d和21d时，Control组与GFP组两基因表达的比较均无统计学差异（P>0.05）。结论：（1）利用AdEasy-1腺病毒载体系统成功构建携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体。（2）经包装、扩增、纯化后成功制备出高滴度值的重组腺病毒Ad-GDF-5能大量表达GDF-5蛋白。（3）体外成功培养的人退行性变椎间盘髓核细胞可作为腺病毒介导GDF-5基因治疗的靶细胞。（4）重组腺病毒Ad-GDF-5能促进人退变椎间盘髓核细胞Aggrecan、CollagenⅡ基因的表达，增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成。（5）重组腺病毒Ad-GDF-5在体外对退行性变髓核细胞具有修复作用，可能是椎间盘退行性变早期基因治疗的新途径。

全文目录


中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
前言  11-16
第一部分 人 GDF-5 重组腺病毒载体的构建及鉴定  16-52
  材料与方法  16-44
  结果  44-52
第二部分 Ad-GDF-5 对人退变椎间盘髓核细胞外基质表达的影响  52-82
  材料与方法  52-67
  结果  67-82
讨论  82-89
结论  89-90
参考文献  90-94
综述一：椎间盘退行性变基因治疗进展  94-105
  参考文献  102-105
综述二：生长分化因子-5 在椎间盘退行性变疾病中的研究进展  105-115
  参考文献  112-115
附录  115-116
攻读学位期间发表文章情况  116-117
致谢  117-119
个人简历  119

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 骨科学（运动系疾病、矫形外科学） > 骨骼疾病 > 脊柱及背疾病 > 脊椎关节病
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