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间充质干细胞治疗三氯丙烷中毒性肝损伤

作　者: 王美华
导　师: 李晓兵
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学
关键词: 骨髓间充质干细胞三氯丙烷肝中毒损伤成角质生长因子
分类号: R595.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景现代工业的飞速发展，化学产品中毒事件不断增加，其中三氯丙烷高剂量中毒导致的严重中毒性肝损伤，病情恶化快，常规保肝药物、人工肝等治疗效果有限，最终导致肝衰竭死亡。文献报告骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）治疗病毒性肝炎，肝硬化，甚至肝脏移植后肝脏损伤，肝功能生化指标较对照组明显恢复。利用BM-MSCs治疗中毒性肝损伤的体内、体外初期实验发现有减少肝脏细胞死亡，促进其再生的作用，但MSC针对三氯丙烷（TCP）中毒肝损伤治疗未见文献报道。因此，我们设计了MSC治疗大鼠TCP中毒肝损伤模型，回答MSC是否可以归巢中毒损伤肝脏，归巢后干细胞变化规律，能否起到肝损伤修复作用，MSC的安全有效剂量，以及通过腺病毒转染增效基因加强MSC修复功能等，为临床救治提供实验参照数据。实验方法与结果1.分离、培养和鉴定大鼠骨髓MSC取SPF级Wistar大鼠100g-130g,雄性,全骨髓贴壁分离法培养大鼠骨髓间充质干细胞，至第4代镜下观察细胞贴壁生长，形态统一，呈一致的梭形或长条形。取4代MSCs分别行流式细胞仪细胞表型检测及成骨、成脂诱导分化实验，结果显示4代MSCs均表达CD105，CD44,不表达CD45和CD34，且在一定诱导条件下，成功向成骨、成脂肪诱导转化。这就说明我们用的全骨髓贴壁分离筛选法可以获得足够量、生长旺盛、高纯度、具有多向分化潜能的大鼠骨髓间充质干细胞。2．三氯丙烷致肝损伤大鼠动物模型建立取40只健康SPF级Wistar大鼠,雌性，体重200g±20g,随机分为4组，每组各10只。A组，正常对照组（注射生理盐水），B组，40ug/kg肝损伤模型组，C组，60ug/kg肝损伤模型组，D组，80ug/kg肝损伤模型组，隔日注射，分别在注射3次、5次、6次、7次取血标本，检验肝功能损害程度，检验项目包括：症状、体征，体重，及血液生化谷丙转氨酶（ALT）、血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(Alb)、总胆红素(TBil)、直接胆红素（DBil）。，实验结果60ug/kg肝损伤模型组可出现明显肝脏中毒症状、体征，及肝脏病理，生化指标变化，而40ug/kg组相对损伤轻，恢复快，80ug/kg相对损伤重，动物早期死亡率高。3．骨髓间充质干细胞在肝损伤大鼠肝脏归巢研究用长效荧光标记剂CM-DiI标记MSC作体内示踪观察。具体方法：雄性大鼠的第4代6x106MSC细胞90%融合后，胰酶消化，用PBS稀释DMSO溶解CM-DiI染剂，放37℃5min。PBS液洗，悬浮。MSCs组：雌性大鼠三氯丙烷（TCP）染毒后1周，CM-DiI标记的雌性鼠的MSC1×10~6/只尾静脉输注；对照组，正常大鼠，不染毒，同样尾静脉输注MSC1×10~6。将移植后3、15和30d的大鼠处死，取其肝脏包埋剂包埋后放入液氮冷冻，病理切片机连续切片，倒置荧光显微镜观察照相。病理结果：正常大鼠输入MSC细胞后12天，发现MSC细胞在骨髓和肠道增生活跃。染毒大鼠移植后15d，可见在受者肝脏中有少量标记细胞，主要集中在汇管区，移植后30d，肝脏中标记细胞进一步增加，出现形态改变，荧光汇集成片向肝小叶分布。4．骨髓间充质干细胞对三氯丙烷所致大鼠肝损伤的保护作用75只SPF级Wistar大鼠,雌性，体重200g±20g,每组15只随机分为5组: A组(正常对照组)；B组（肝损伤模型组TCP+PBS）腹腔注射质量分数为三氯丙烷60ug/kg,4h后经尾静脉注射1mlPBS;C组（高剂量MSCs治疗组TCP+MSC)腹腔注射质量分数为三氯丙烷60ug/kg,4h后经尾静脉注射MSCs，1×10~6/只(重悬于1mlPBS中);D组（低剂量MSCs治疗组TCP+MSCs)腹腔注射质量分数为三氯丙烷60ug/kg,4h后经尾静脉注射MSCs-EGFP，1×10~5/只(重悬于1mlPBS中);E组（MSCs对照组MSCs+PBS)腹腔注射等量的PBS，4h后经尾静脉注射MSCs，1×10~6/只(重悬于1mlPBS中)。观察各组大鼠的一般情况，血液肝功能，同时行肝组织病理学观察。结果显示MSCs治疗组大鼠肝损伤生化指标好于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.KGF基因通过腺病毒载体转染小鼠MSC实验研究为了将角质生长因子（KGF）基因通过腺病毒载体转染到MSC中，增强MSC修复功能。利用DNA重组技术，将目的基因KGF克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中，然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中，构建重组腺病毒载体质粒，继而在H293细胞中包装、扩增，并测定病毒滴度。转染至小鼠MSC中。为下步无关MSC输注及基因改造MSC保证及放大MSC修复功能的干细胞活性实验提供前期平台。结论1、全骨髓贴壁分离法可成功分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，并在体外稳定培养。2、60ug/kg三氯丙烷可成功建立大鼠肝脏中毒实验模型。3、荧光标记的MSCs可以在三氯丙烷中毒后损伤肝组织植入。4、MSC可以归巢到TCP染毒的大鼠肝损伤动物模型，并出现增值现象，同时有效的促进了损伤肝脏血清生化指标的恢复，减轻了病理中毒损伤。验证了1X106MSC是安全有效的治疗剂量。为MSC治疗中毒性肝损伤患者提供有效的临床前期实验数据。5.携带增KGF基因的腺病毒可以成功转染小鼠骨髓间充质干细胞

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
技术路线  14-15
第一部分．分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞  15-22
  材料和方法  15-21
    一、材料  15-17
    二、方法  17-18
    五.结果  18-21
  讨论  21-22
第二部分三氯丙烷致肝损伤大鼠动物模型建立  22-38
  材料和方法  22-36
    1 材料  22-24
    2 方法  24-26
    3 结果  26-36
  讨论  36-38
第三部分骨髓间充质干细胞肝损伤大鼠肝脏归巢研究  38-45
  材料和方法  38-39
  实验方法  39-40
  结果  40-43
  讨论  43-45
第四部分骨髓间充质干细胞对三氯丙烷所致大鼠肝损伤的修复作用  45-56
  材料和方法  45-54
    1.材料  45-46
    2 实验方法  46-48
    3 结果  48-54
  讨论  54-56
第五部分构建重组腺病毒并转染小鼠骨髓间充质细胞  56-64
  材料与方法  56-59
  结果  59-62
  讨论  62-64
结论  64-65
参考文献  65-68
文献综述  68-75
  Reference  73-75
附已发表论著  75-86
个人简历  86-87
致谢  87

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