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COPD大鼠气道成纤维细胞转染rHSG基因后观察细胞增殖、凋亡及与TGF-β1、PDGF表达水平关系

作　者: 李波
导　师: 葛正行
学　校: 贵阳中医学院
专　业: 中西医结合临床
关键词: 转染 rHSG COPD 气道成纤维细胞气道重塑
分类号: R563.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：本研究通过构建携带增殖抑制基因(rHSG)的真核表达载体,转染至慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气道成纤维细胞,观察COPD大鼠气道成纤维细胞增殖、凋亡及转化生长因子(TGF-β1)、血小板衍生长因子(PDGF)表达水平关系,为干预气道成纤维细胞增殖引起肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病,打下基因治疗基础,并为寻找到延缓COPD病情进展提供了理论依据。方法：采用SD雄性大鼠构建COPD大鼠模型,运用组织块贴壁法,体外培养COPD大鼠气道原代成纤维细胞,并用波形蛋白鉴定细胞,取3代细胞进行后续实验。通过分子克隆,构建携带rHSG基因的真核表达载体,实验分组为：对照组(COPD模型未转染组)、空载体pEGFP-nl组、转染pEGFP-rHSG组,实验将阳离子脂质体作为转染介质,把重组质粒转染到COPD模型大鼠气道成纤维细胞,分别感染24小时、48小时、3天、5天、7天后,使用MTT方法检测转染后成纤维细胞增殖凋亡情况；Western blot检测转染后rHSG、TGF-β1、PDGF蛋白含量；提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1、PDGF及rHSGmRNA的表达水平。对数据进行统计学分析,应用SPSS18.0软件,得到实验数据用x±s表示,采用单因素方差分析均数、标准差,P<0.05为有显著性统计学意义。结果：COPD大鼠气道成纤维细胞原代培养成功,经过免疫组化,波形蛋白鉴定呈阳性。随着rHSG基因转染大鼠气道成纤维细胞时间延长,rHSG基因转染组明显比模型对照组对成纤维细胞的增殖有抑制作用；TGF-β1、PDGF两个基因的mRNA表达量减少出现在转染24小时,其mRNA的表达量减少值达到了最大在7天的时侯,在5天-7天时候mRNA表达量也有减少,但是幅度较前减小各转染组间TGF-β1、PDGFmRNA表达量差别,满足P<0.05。当pEGFP-rHSG转染到细胞24小时,rHSGmRNA表达量开始增加,增加值达到最大在7天的时侯,而转染5d-7d时表达仍有继续增加,但增加幅度较前面明显,各转染组间rHSG mRNA表达差别满足P<0.05。结论：rHSG基因与TGF-β1、PDGF基因的平衡关系被打破,是COPD气道重塑中至关因素。rHSG基因转染组随着感染时间延长明显够抑制COPD气道成纤维细胞增殖,相反COPD气道成纤维细胞中TGF-β1与PDGF随着rHSG基因感染时间延长出现低表达,证实当外源性rHSG基因转染到COPD大鼠气道成纤维细胞,能够调节TGF-β1、PDGF基因的过度表达,进而使气道成纤维细胞的增殖受到抑制。因此高效率的rHSG基因转染有可能会在一定程度上延缓COPD气道重塑进展。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-12
第一部分 COPD大鼠模型构建及气道成纤维细胞原代培养  12-20
  1  12-13
    1.1 主要试剂与仪器  12-13
    1.2 常用试剂配置  13
  2.构建COPD大鼠模型  13-16
    2.1 实验动物  13
    2.2 实验分组  13-14
    2.3 实验方法  14-16
      2.3.1 COPD模型大鼠造模方法及鉴定  14
      2.3.2 组织标本采集及原代培养方法  14-15
      2.3.3 细胞传代培养  15
      2.3.4 细胞冻存  15
      2.3.5 细胞复苏  15-16
      2.3.6 成纤维细胞的纯化  16
      2.3.7 成纤维细胞的鉴定  16
  3 实验观测指标  16-17
  4 结果  17-20
    4.1 COPD大鼠造模鉴定结果  17-18
    4.2 COPD大鼠和正常大鼠气道成纤维细胞原代培养鉴定结果  18-19
    4.3 成纤维细胞纯化及波形蛋白鉴定  19-20
第二部分：重组大鼠质粒pEGFP-rHSG/Mfn2的构建及体外转染对COPD大鼠气道成纤维细胞增值影响  20-43
  一、重组大鼠质粒pEGFP-rHSG/Mfn2的构建  20-30
    1.材料与仪器  20-23
    2 实验方法  23-28
      2.1 从大鼠气道成纤维细胞细胞中抽提总RNA  23-24
      2.2 RNA反转录成cDNA  24
      2.3 引物设计  24-25
      2.4 基因的PCR扩增  25-26
      2.5 目的片段的与目的载体的连接  26-27
      2.7 抽提质粒  27
      2.8 质粒鉴定  27-28
    3 实验结果  28-30
  二、体外转染对COPD大鼠气道成纤维细胞增值影响  30-43
    1 稀释脂质体转染成纤维细胞  30
    2 血球计数板计数  30
    3 MTT转染不同时间细胞生长增殖能力测定  30-31
    4 Western blot法检测转染后各组rHSG、TGF-β1、PDGF蛋白表达情况  31-33
    5 RT-PCR检测rHSG、TGF-β1、PDGFmRNA的表达  33-37
    6 统计学处理数据  37
    7 结果  37-43
讨论  43-46
结论  46-47
参考文献  47-49
附录一缩略语表  49-50
附录二综述  50-59
  参考文献  56-59
附录三致谢  59-60
附录四个人简介  60

COPD大鼠气道成纤维细胞转染rHSG基因后观察细胞增殖、凋亡及与TGF-β1、PDGF表达水平关系

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