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志贺氏菌多克隆、单克隆及基因工程抗体的制备与免疫层析试纸条的初步研制

作　者: 徐迪
导　师: 魏华; 徐锋
学　校: 南昌大学
专　业: 微生物学
关键词: 志贺氏菌 多克隆抗体 单克隆抗体 基因工程抗体 胶体金免疫层析试纸条
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 4次
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内容摘要


志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引发我国感染性腹泻、严重危害人类健康的食源性致病菌。它主要侵害结肠,引发溃疡、粘液性血性腹泻,对婴幼儿有较高的感染率和死亡率。加强对志贺氏菌的监测,有助于预防和控制大规模感染疫情的爆发。目前,针对食源性致病菌的检测方法主要有传统的生化培养、PCR检测和免疫学方法等。免疫学方法因其简单、快速、成本低廉等优点而备受青睐。本文旨在制备多种抗志贺氏菌的抗体,建立一种快速、简便筛查志贺氏菌的胶体金免疫试纸条检测方法,用于其临床诊断及食品卫生监测。采用志贺氏菌混合菌体碎片作为免疫原免疫家兔,制备获得了效价为1：1280000的抗血清。经菌体逆向吸附法和辛酸硫酸铵沉淀法纯化后,有效去除了与大肠杆菌和阪崎肠杆菌等杂菌的交叉反应,获得了抗志贺氏菌的多克隆抗体。通过细胞融合技术,筛选得到4株能稳定分泌抗志贺氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用辛酸硫酸铵沉淀法对单克隆细胞株4G9的腹水进行纯化,获得单克隆抗体,可与纯化多抗配对使用。用胶体金标记单克隆抗体,将多克隆抗体和驴抗鼠IgG分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线,制备了志贺氏菌的胶体金免疫层析试纸条。检测志贺氏菌纯培养物的灵敏度为105CFU/mL:在添加108CFU/mL的长双歧杆菌和阪崎肠杆菌的干扰下,其牛奶样品中的志贺氏菌的灵敏度为106CFU/mL.本文从制备的志贺氏菌单抗细胞株4G9中获得了VL、VH基因的序列,发现其分别属于κ链和γ链。由于VL经比对发现存在终止密码子,因此只把VH分别构建到pET-lic、pGEX-4T-1载体中,转入大肠杆菌中表达,通过ELISA方法验证了两种表达产物均能与志贺氏菌结合,但亲和力较低,不适合用于制备检测志贺氏菌的免疫层析试纸条。本文研究结果将为建立其它食源性致病菌的快速检测方法,提供可借鉴的研究模式。

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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