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测定荧蒽和酮洛芬的酶联免疫检测新方法研究

作　者: 王晓敏
导　师: 庄惠生
学　校: 上海交通大学
专　业: 环境科学
关键词: 荧蒽酮洛芬多克隆抗体间接竞争酶联免疫吸附试验
分类号: TQ460.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文选择荧蒽(Fluoranthene, FL)作为多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)的代表,进行衍生化,合成半抗原;选择酮洛芬(Ketoprofen, KET)作为非甾体抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)的代表,可直接作为半抗原。将他们分别与两种载体蛋白偶联合成人工抗原。用合成的免疫原免疫大白兔,制备出高效价的抗FL抗体、抗KET抗体。分别以抗FL抗血清、抗KET血清为核心建立了检测荧蒽、酮洛芬的间接竞争酶联免疫吸附测定法(ic-ELISA法)。主要研究结果如下:1.荧蒽和酮洛芬人工抗原的合成及鉴定采用活化酯法,将荧蒽、酮洛芬分别与牛血清白蛋白(BSA)偶联,制得免疫原FL-BSA、KET-BSA;用混合酸酐法将两种物质分别与OVA偶联,制备包被原FL-OVA、KET-OVA。经过彻底透析后,通过紫外进行鉴定,紫外扫描图谱显示人工抗原合成成功。用考马斯亮蓝法计算出偶联物FL-BSA、KET-BSA、FL-OVA、KET-OVA的浓度分别为3.95 mg/mL、5.25 mg/mL、5.95 mg/mL、4.28 mg/mL,并计算其偶联比分别是16: 1、10: 1、13: 1、9: 1。2.多克隆抗体的制备及效价的测定用免疫原FL-BSA、KET-BSA分别免疫大白兔,制备出两种血清:抗FL血清、抗KET血清。抗FL抗体、抗KET抗体的最高效价分别为6.4×104、1.28×105。3.间接竞争酶联免疫吸附测定法(ic-ELISA法)的建立通过对检测步骤、检测条件等因素进行优化,得到ELISA检测方法的灵敏度、线性范围、标准曲线。结果显示较合适的检测条件为:FL、KET包被抗原浓度为1:2000,抗FL抗体、抗KET抗体使用浓度均为1:8000;最佳包被时间均为4℃,过夜;最佳封闭液均为0.5%明胶;最佳封闭时间均为1.0 h;一抗最佳作用条件均为37℃,60 min;二抗最佳作用条件均为37℃,60 min。用优化后的ic-ELISA检测法,建立标准曲线:FL标准曲线,线性范围为10 ng/L~10μg/L,IC50是0.142 ng/mL,最低检测限(LOD)为2.01 ng/L,回归方程为y=-21.64x+96.55 (R2=0.960),与结构类似物交叉反应率较低;KET标准曲线,线性范围为10 ng/L~10μg/L,IC50是0.235 ng/mL,最低检测限为4.26 ng/L,回归方程为y=-22.97x+104.46(R2=0.980),与结构类似物交叉反应率较低。两种物质所建立的方法的批内Cv及批间Cv均在10%以内,符合方法所需的精密度要求。4.实际样品的测定建立HPLC测定两种物质的标准曲线:FL的回归方程为y=35126.00x+5363.46(R2=0.999);KET的回归方程为y=41440.05x+3563.48(R2=0.998)。以建立的ELISA检测方法及HPLC对添加在水样中的样品进行回收,测定FL、KET在水样中的添加回收率为88%~110%,三个平行的变异系数在2%~8%之间;用建立的ic-ELISA法测定实际水样中的FL、KET,并与HPLC方法进行比较,均有不同程度的荧蒽及酮洛芬检出。综合分析,本文成功的制备了FL及KET的人工抗原,经动物免疫获得了高效价的抗血清,可用于建立FL、KET的间接ELISA方法。经优化,建立了FL、KET的标准曲线,与结构类似物的交叉反应不明显,可以用于含有FL、KET的环境样品的初筛选,为研究和开发FL、KET的ELISA试剂盒奠定了基础。

全文目录

摘要  10-13
ABSTRACT  13-16
第一章绪论  16-32
  1.1 课题研究对象  16-21
    1.1.1 荧蒽  16-19
    1.1.2 酮洛芬  19-21
  1.2 研究进展及存在问题  21-26
    1.2.1 荧蒽  21-24
    1.2.2 酮洛芬  24-26
  1.3 免疫检测技术  26-29
    1.3.1 多克隆抗体和单克隆抗体  26-27
    1.3.2 抗原抗体结合反应  27
    1.3.3 抗原选择与免疫  27-28
    1.3.4 免疫检测原理  28-29
    1.3.5 酶联免疫测定法  29
  1.4 课题研究的目的和意义  29-30
    1.4.1 本课题研究的主要目的  29-30
    1.4.2 意义  30
  1.5 课题的研究内容和技术路线  30-31
    1.5.1 研究内容  30-31
  1.6 小结  31-32
第二章荧蒽及酮洛芬人工抗原的合成  32-44
  2.1 实验材料  32-33
    2.1.1 试剂与溶液  32
    2.1.2 仪器与材料  32-33
  2.2 实验方法  33-38
    2.2.1 荧蒽及酮洛芬人工抗原的合成  33-37
    2.2.2 半抗原与载体蛋白偶联物的鉴定  37
    2.2.3 偶联物浓度的测定  37-38
    2.2.4 偶联物偶联比的计算  38
  2.3 结果与讨论  38-43
    2.3.1 荧蒽及酮洛芬人工抗原的鉴定  38-41
    2.3.2 偶联物浓度的测定及偶联比的计算  41-43
  2.4 本章小结  43-44
    2.4.1 荧蒽及酮洛芬结构类似物的设计  43
    2.4.2 荧蒽及酮洛芬抗原的合成与鉴定  43-44
第三章抗荧蒽和抗酮洛芬抗体的制备与鉴定  44-57
  3.1 实验材料  44-45
    3.1.1 试剂与溶液  44-45
    3.1.2 仪器与材料  45
  3.2 实验方法  45-53
    3.2.1 抗血清的制备  45-49
    3.2.2 抗血清的纯化与保存  49-51
    3.2.3 抗体效价的测定  51-53
  3.3 结果与讨论  53-56
    3.3.1 效价的变化  53-55
    3.3.2 纯化后抗体  55-56
  3.4 本章小结  56-57
第四章间接竞争ELISA检测方法的建立  57-81
  4.1 实验材料  57-58
    4.1.1 试剂与溶液  57
    4.1.2 仪器与材料  57-58
  4.2 实验方法  58-60
    4.2.1 间接竞争ELISA方法的优化  58-60
    4.2.2 标准曲线的绘制  60
    4.2.3 间接竞争ELISA方法特异性检测  60
    4.2.4 间接竞争ELISA方法重复性的检测  60
  4.3 结果与讨论  60-79
    4.3.1 间接竞争ELISA方法的优化  60-74
    4.3.2 标准曲线的绘制  74-76
    4.3.3 间接竞争ELISA方法特异性评价  76-78
    4.3.4 间接竞争ELISA方法重复性的检测  78-79
  4.4 本章小结  79-81
第五章环境水样中荧蒽和酮洛芬的测定  81-93
  5.1 实验材料  81
    5.1.1 试剂及溶液  81
    5.1.2 仪器与材料  81
  5.2 实验方法  81-85
    5.2.1 样品处理  81-82
    5.2.2 高效液相色谱法测定  82-83
    5.2.3 间接竞争ELISA检测步骤  83-84
    5.2.4 添加回收率测定  84
    5.2.5 实际样品的测定  84-85
  5.3 结果与讨论  85-92
    5.3.1 高效液相色谱法的建立  85-89
    5.3.2 间接竞争ELISA检测  89-90
    5.3.3 实际样品的测定  90-92
  5.4 本章小结  92-93
第六章总结  93-96
  6.1 研究成果  93-95
    6.1.1 人工抗原的合成  93
    6.1.2 多克隆抗体的制备  93
    6.1.3 ELISA条件的选择与优化  93-94
    6.1.4 酶联免疫吸附分析方法的建立  94
    6.1.5 实际样品的测定  94-95
  6.2 存在问题和不足  95
  6.3 应用前景及发展方向  95-96
参考文献  96-107
缩略词表  107-108
致谢  108-109
攻读硕士学位期间已录用的论文  109

测定荧蒽和酮洛芬的酶联免疫检测新方法研究

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