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猪链球菌2型二元调控系统2148hk/rr的研究

作　者: 尉研
导　师: 秦鄂德; 姜永强
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 猪链球菌2型二元调控系统2148hk/rr DNA芯片毒力因子
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪链球菌（Streptococcus suis, S. suis）是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌,根据荚膜多糖（capsular polys-accharide, CPS）抗原特性差异,可将其分为35种血清型（1-34型,1/2型）。其中以猪链球菌2型（S. suis serotype 2, SS2）分布最广,致病性最强。人感染SS2后,通常出现化脓性脑膜炎、心内膜炎、伴有耳聋、运动功能紊乱等症状。1998年和2005年我国暴发的猪链球菌疫情出现了典型的链球菌中毒性休克综合征（STSS）临床症状,其发病急、病程短及高致死率等特点引起了国内外学者的广泛关注。目前对猪链球菌,尤其是我国猪链球菌流行株了解甚少,缺乏对猪链球菌毒力因子和致病机制的全面了解。虽然有几类毒力因子已被确认与猪链球菌的致病性相关,如具有抗吞噬作用的荚膜多糖（CPS）、胞外因子（EF）、溶菌酶释放蛋白（MRP）、溶血素（SLY）、精氨酸氨基肽酶（ADiS）等。国内外还鉴定出了一些可能的毒力因子,但多涉及毒力相关因子的功能性鉴定。由于不同菌株所具有的毒力因子各不相同,同一种毒力因子在不同菌株中的作用也不一定相同,同时单独研究毒力因子的功能并不能深入解释SS2的致病机制,因此研究这些毒力因子在SS2致病过程中是如何受到调控并共同发挥作用将更为重要。二元调控系统（two-component signal transduction system, TCSTS）是细菌在特定的环境下维持生存的一种重要的调控机制。细菌感染宿主的过程,是各个毒力相关基因在调控系统的复杂有序的调节下,共同发挥作用完成的。二元调控系统能够感应特定的外界信号,介导特定基因的表达,是细菌调节自身功能和毒力的中枢系统。我国猪链球菌强致病株05ZYH33中存在13个TCSTS和2个孤儿反应调控因子。猪链球菌05ZYH33的二元调控系统2148hk/rr是根据其编码基因所在阅读框的位置命名而来的。经同源性比对发现,该调控系统与产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens, C.perfringens）VirR/S的氨基酸序列一致性为30%。因此,本研究以二元调控系统2148hk/rr为研究对象,分析其在猪链球菌05ZYH33全基因组中的调控作用。二元调控系统2148hk/rr基因敲除突变株△2148hk/rr在菌落形态上和野生株相比无显著变化,但是生长速度略微缓慢。Hep2细胞黏附实验显示,突变株的黏附能力和野生株相比显著降低。体外全血杀伤实验也证实突变株更容易被其中的免疫细胞杀伤。腹腔注射CD1小鼠和耳缘静脉注射40日龄仔猪竞争感染实验表明,突变株在动物体内无法增殖,且表现出在血液中被清除的迹象,和体外的全血杀伤实验结果基本一致。细胞和动物实验从体外、体内两方面均证实突变株△2148hk/rr毒力下降。DAN芯片转录谱数据显示突变株△2148hk/rr共有426个基因在转录水平发生变化（2倍以上）,占全基因的19.42%,其中上调基因256个,下调基因170个。其中二元调控系统2148hk/rr能够对参与荚膜多糖合成的基因簇进行正向调控,2148hk/rr基因敲除后,与CPS合成相关的14个开放阅读框SSU05₀564-0577均发生了转录水平的下调,这些基因簇的变化使得突变株△2148hk/rr的荚膜明显变薄,荚膜的部分缺陷是突变株更易被鼠巨噬细胞吞噬以及在血液中快速被清除的主要原因。二元调控系统2148hk/rr还能够参与糖类、氨基酸、核苷酸、无机离子的代谢调节以及DNA的合成、修复等,基因敲除2148hk/rr后引发了胞内的代谢失衡。DAN芯片转录谱数据显示,2148hk/rr基因敲除后,猪链球菌05ZYH33中其它5个二元调控系统SalK/R、CiaR/H、YycF/G（SSU05₁358-1360）、1596hk/rr（SSU05₁595-1596）、0884hk/rr（SSU05₀883-0884）均发生了转录水平的下调,说明这些调控系统受到二元调控系统2148hk/rr的正向调控。为了进一步确定比较转录谱实验数据的可靠性,鉴定二元调控系统2148hk/rr的调控元,筛选出可能受2148hk/rr直接调控的45个基因,进行实时定量RT-PCR验证。结果显示两者之间具有显著的相关性（R2 = 0.926）,两种方法检测的45个基因的转录变化基本趋势一致。随后对二元调控系统2148hk/rr调控靶基因进行操纵子预测,筛选其中6个操纵子进行凝胶阻滞实验（EMSA）验证:SSU05₀564-0577,SSU05₀578-0581,SSU05₀624-0628,SSU05₁094-1095,SSU05₁216-1221,SSU05₁778-1780。体外EMSA实验显示,2148rr调控蛋白不能直接与基因SSU05₁403、以及其余6个操纵子首基因的启动子区结合,因此认为二元调控系统2148hk/rr对以上基因行使间接调控功能。对猪链球菌05ZYH33中其它7个调控系统SalK/R、CovR、RevS、CiaR/H、LuxS、1910hk/rr、1661hk/rr分别进行DNA芯片转录谱分析,按照COG功能分类对所有DNA芯片转录谱数据进行聚类,综合8个调控系统的聚类结果,发现二元调控系统2148hk/rr是荚膜形成中的主要调控系统,而其它调控系统1661hk/rr、CiaR/H、1910hk/rr、SalK/R只是对荚膜多糖合成过程中某几个基因进行调控,并不能产生表型上的影响。另外CiaR/H和1910hk/rr对参与氨基酸、核苷酸转运和代谢,细胞外膜合成的相关基因拥有相似的调控范围和调控趋势。同时还发现主要参与应激应答的二元调控系统CiaH/R是89K毒力岛的一个负向全局调控系统。通过聚类分析还发现编码溶血素的基因SSU05₁403（sly）在突变株SalK/R、CiaR/H、CovR、2148hk/rr中,均发生转录水平的上调,其中2148hk/rr、SalK/R、CiaR/H基因敲除后毒力减弱,而CovR已证实敲除后毒力增强,说明二元调控系统突变株中sly转录水平的上调并不能完全导致突变株毒力的增强,二元调控系统突变株毒力的变化,是多个毒力因子转录水平变化后平衡的结果,这也从另一个角度凸显了猪链球菌毒力因子存在着的复杂性和多样性。

全文目录

缩略词表  6-8
摘要  8-11
Abstract  11-14
前言  14-24
  1 研究目的与意义  14-15
  2 猪链球菌概况  15
  3 二元调控系统基本特点  15
  4 国内外研究现状分析  15-22
    4.1 肺炎链球菌中二元调控系统的研究进展  16-17
    4.2 其它病原菌中二元调控系统的研究进展  17-18
    4.3 猪链球菌2 型毒力因子的研究进展  18-19
    4.4 猪链球菌2 型二元调控系统的研究进展  19-22
  5 产气荚膜梭菌中VirR/S 的研究进展  22
  6 本研究的目的和方法路线  22-24
第一部分二元调控系统2148hk/rr 与毒力的相关性分析  24-35
  1 引言  24-25
  2 材料和方法  25-27
    2.1 材料  25
    2.2 方法  25-27
      2.2.1 细菌培养  25
      2.2.2 △2148hk/rr 生物性状分析  25-26
      2.2.3 人喉癌上皮细胞Hep2 黏附实验  26
      2.2.4 小鼠巨噬细胞RAW264.7 吞噬实验  26
      2.2.5 全血杀伤实验  26
      2.2.6 CD1 小鼠竞争感染及攻毒实验  26-27
      2.2.7 仔猪竞争感染实验  27
  3 结果  27-32
    3.1 突变株△2148hk/rr 的生物性状结果分析  27-28
    3.2 Hep2 细胞黏附实验结果分析  28-29
    3.3 小鼠巨噬细胞RAW264.7 吞噬实验结果分析  29-30
    3.4 全血杀伤实验结果分析  30
    3.5 CD1 小鼠竞争感染与攻毒实验结果分析  30-31
    3.6 仔猪竞争感染实验结果分析  31-32
  4 讨论  32-34
  5 结论  34-35
第二部分二元调控系统2148hk/rr 的基因转录谱分析  35-55
  1 引言  35-36
  2 材料和方法  36-43
    2.1 材料  36
    2.2 方法  36-43
      2.2.1 DNA 芯片转录谱分析  36-40
      2.2.2 实时定量PCR 验证  40-42
      2.2.3 鉴定2148hk/rr 操纵子  42
      2.2.4 透射电镜观察突变株△2148hk/rr 荚膜变化  42-43
      2.2.5 突变株△2148hk/rr 溶血活性分析  43
  3 结果  43-52
    3.1 2148hk/rr 的生物信息学分析和操纵子鉴定  43
    3.2 DAN 芯片转录谱分析总体概述  43-44
    3.3 差异基因的功能分类  44-50
    3.4 实时定量RT-PCR 结果分析  50
    3.5 透射电镜结果分析  50-51
    3.6 溶血活性分析结果分析  51-52
  4 讨论  52-54
  5 结论  54-55
第三部分二元调控系统2148hk/rr 调控方式分析  55-70
  1 引言  55-56
  2 材料和方法  56-63
    2.1 材料  56-57
    2.2 方法  57-63
      2.2.1 重组质粒pET28a-2148 的构建  57-58
      2.2.2 2148rr 目的蛋白表达与纯化  58-59
      2.2.3 调控靶基因操纵子的预测  59
      2.2.4 凝胶阻滞实验  59-61
      2.2.5 LacZ 报告基因融合实验  61-63
  3 结果  63-68
    3.1 表达质粒pET28a-2148 的构建  63-64
    3.2 2148rr 调控蛋白的表达纯化和浓度测定  64-65
    3.3 2148rr 调控靶基因操纵子预测结果  65-66
    3.4 凝胶阻滞实验结果分析  66-67
    3.5 LacZ 融合表达质粒构建  67-68
    3.6 β-半乳糖苷酶活性检测  68
  4 讨论  68-69
  5 结论  69-70
第四部分多个二元调控系统DNA 芯片转录谱的综合分析  70-89
  1 引言  70-71
  2 材料与方法  71-72
    2.1 材料  71
    2.2 方法  71-72
      2.2.1 细菌培养及生长曲线的测定  71
      2.2.2 多个二元调控系统DNA 芯片转录谱分析  71
      2.2.3 已知或可能的毒力基因（簇）转录的多通路调节  71-72
      2.2.4 多个二元调控系统DNA 芯片转录谱的聚类分析  72
  3 结果  72-87
    3.1 多个突变株生长速度的比较  72
    3.2 多个二元调控系统的转录谱数据的功能分类  72-75
    3.3 已知或可能的毒力基因（簇）多通路调节结果分析  75-78
      3.3.1 89K 毒力岛多通路调节分析  75
      3.3.2 参与荚膜多糖合成基因簇的多通路调节分析  75-76
      3.3.3 其它毒力相关基因的多通路调节分析  76-78
    3.4 多个二元调控系统DNA 芯片转录谱的聚类结果分析  78-87
  4 讨论  87-88
  5 结论  88-89
结语  89-90
参考文献  90-99
文献综述  99-116
  参考文献  109-116
附录  116-155
在读期间发表论文情况  155-156
发表文章  156-162
个人简介  162-163
致谢  163

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