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猪链球菌2型GlnA和GlnR对TCA循环酶调控的研究

作　者: 常海涛
导　师: 陈焕春；贝为成
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型 GlnA和GlnR TCA循环 乌头酸酶
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪链球菌2型(Streptococcus suis Serotype 2, S. suis 2)编码谷氨酰胺合成酶及其转录调控因子的基因分别是glnA和glnR。通过构建glnA和glnR的基因缺失株ΔGlnA和ΔGlnR,分别感染CD1小鼠发现突变株ΔGlnR和ΔGlnA毒力都有所下降,且ΔGlnA毒力下降非常显著,在各组织器官活菌数与野生株相比显著降低。这些结果说明谷氨酰胺合成酶在猪链球菌2型感染过程中,尤其在粘附和定植过程中发挥着重要的作用。通过生物信息学分析,在乌头酸酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶操纵子启动子区发现了GlnR结合的保守序列,而异柠檬酸脱氢酶的产物α-酮戊二酸又可以在谷氨酸脱氢酶的作用下生成谷氨酸,和谷氨酰胺代谢相关。因此,我们推测谷氨酰胺代谢和三羧酸循环(TCA循环)中有着一定的联系。本研究以猪链球菌2型SC19为亲本菌株,开展了如下工作：1. GlnR和GlnA原核表达、纯化及GlnA的体外定点突变参考NCBI的Genbank中猪链球2型05ZYH33基因组序列,以SC19的基因组DNA为模板,PCR分别扩增glnA和glnR基因,将扩增的基因连接到原核表达载体pET28a,构建了表达质粒pET28a-glnR、pET28a-glnA。预测了GlnA的可能关键氨基酸位点且通过重叠延伸PCR介导的定点突变将GlnA的54、67、133和308位氨基酸进行了定点突变,同样构建原核表达载体后转化到大肠杆菌表达菌株BL21中,经诱导表达,得到了目的蛋白。将目的蛋白纯化并检测GlnA及氨基酸位点突变的GlnA酶活,发现67和133位的氨基酸突变后酶活丢失,是GlnA关键酶活位点。2. GlnR和GlnA对TCA循环酶调控的研究利用实时荧光定量PCR检测了ΔGlnR、AGlnA突变株和WT野生菌株TCA循环中乌头酸酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶基因的表达情况。结果显示：乌头酸酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶在ΔGlnR、AGlnA表达都比WT低。而PCR扩增该操纵子的启动子,并将与GlnR结合的DNA进行了定点突变,通过电泳迁移率实验发现GlnR能够与该启动子的保守区域结合,且结合不依赖GlnA的互作。3.猪链球菌2型乌头酸酶基因突变株AAcnA的构建PCR分别扩增了乌头酸酶基因的上游片段、下游片段和红霉素抗性基因,按上游片段、红霉素抗性基因、下游片段的顺序共同连接到温敏型自杀性质粒pSET4s上,得到重组质粒pSET4s-AcnA。将重组质粒pSET4s-AcnA电转化到SC19感受态细胞中,通过抗性和温度筛选到对壮观霉素敏感而对红霉素不敏感的菌落,再用PCR、RT-PCR和测序确认突变株ΔAcnA构建成功。4.突变株ΔAcnA的生物学特性研究对ΔAcnA突变株和WT进行一系列生物学特性分析(遗传稳定性、生长曲线、形态结构、溶血活性、细胞感染实验和小鼠半数致死量)。结果显示ΔAcnA在对数生长期后期生长速度有所减慢,对Hep-2细胞的粘附和侵入能力有所上升,其它特性与野生菌株相比没有显著差异,表明乌头酸酶对猪链球菌2型的毒力没有影响。这些结果说明GlnA和GlnR对猪链球菌2型毒力的影响并不是通过调控TCA循环来发挥作用。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-11
1. 前言  11-19
  1.1 猪链球菌病  11
  1.2 猪链球菌2型毒力因子  11-13
    1.2.1 主要毒力因子  11-12
    1.2.2 新的毒力相关因子  12-13
  1.3 谷氨酰胺代谢和TCA循环及乌头酸酶概述  13-19
    1.3.1 谷氨酰胺代谢  13-15
    1.3.2 TCA循环  15-18
    1.3.3 乌头酸酶  18-19
2. 研究目的和意义  19-20
3. 材料与方法  20-35
  3.1 材料  20-26
    3.1.1 菌株、质粒和培养条件  20-21
    3.1.2 动物和细胞  21-22
    3.1.3 主要药品和试剂  22
    3.1.4 主要使用仪器  22
    3.1.5 培养基及抗生素的配制  22-23
    3.1.6 主要溶液配制  23-24
    3.1.7 引物  24-26
  3.2 方法  26-35
    3.2.1 猪链球菌2型的复苏及基因组DNA的提取  26
    3.2.2 PCR扩增  26
    3.2.3 重叠延伸PCR介导的定点突变  26-27
    3.2.4 DNA的纯化与回收  27
    3.2.5 DNA与载体的连接反应  27
    3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  27-28
    3.2.7 连接产物的转化  28
    3.2.8 质粒的小量制备(碱裂解法)  28
    3.2.9 重组质粒的酶切鉴定  28
    3.2.10 蛋白质的诱导表达  28-29
    3.2.11 蛋白质的鉴定(SDS-PAGE)  29
    3.2.12 蛋白纯化  29-30
    3.2.13 蛋白质浓度的测定  30
    3.2.14 电泳迁移率实验(EMSA)  30-31
    3.2.15 RNA的提取  31
    3.2.16 RNA的反转录(RT-PCR)  31-32
    3.2.17 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)  32
    3.2.18 猪链球菌2型感受态细胞的制备  32
    3.2.19 猪链球菌2型的电转化  32
    3.2.20 突变株的筛选和鉴定  32-33
    3.2.21 遗传稳定性分析  33
    3.2.23 菌落形态和溶血活性的比较  33
    3.2.24 细菌透射电子显微镜观察  33
    3.2.25 细胞感染实验  33-34
    3.2.26 小鼠的半数致死量实验  34-35
4. 结果与分析  35-50
  4.1 谷氨酰胺合成酶及GlnA及其转录因子GlnR对TCA循环酶调控的研究  35-42
    4.1.1 谷氨酰胺合成酶glaA及其转录因子glnR的克隆  35
    4.1.2 glnA基因的体外定点突变  35-37
    4.1.3 原核表达载体的构建  37-38
    4.1.4 GlnR、GlnA及其突变蛋白的表达  38-39
    4.1.6 GlnA及其突变蛋白的酶活分析  39-40
    4.1.7 电泳迁移率实验  40
    4.1.8 实时荧光定量PCR  40-42
  4.2 猪链球菌2型乌头酸酶AcnA生物学特性研究  42-50
    4.2.1 乌头酸酶基因上下游同源臂和红霉素抗性基因的扩增  42-43
    4.2.2 温敏型自杀性重组质粒pSET4s-AcnA的构建  43-44
    4.2.3 猪链球菌2型AcnA基因缺失突变株△AcnA的筛选  44-46
    4.2.4 遗传稳定性鉴定  46
    4.2.5 生长曲线分析  46
    4.2.6 形态结构比较  46-47
    4.2.7 溶血活性比较  47-48
    4.2.8 细胞感染实验  48
    4.2.9 小鼠半数致死量  48-50
5. 讨论  50-54
  5.1 谷氨酰胺合成酶及其转录因子调控机制探讨  50
  5.2 关于TCA循环酶的选择  50-51
  5.3 关于乌头酸酶的选择  51
  5.4 重叠延伸PCR技术选择  51-52
  5.5 谷氨酰胺合成酶及其转录因子对TCA循环酶的调控  52
  5.6 突变株△AcnA的构建与筛选  52
  5.7 突变株△AcnA的生物学性状  52-54
6. 结论  54-55
参考文献  55-58
致谢  58

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌 > 球菌
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