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猪链球菌2型在猪脑内及热和氧应激条件下表达上调基因的筛选与功能研究

作　者: 刘磊
导　师: 周锐
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型 SCOTS 脑组织 热应激 厌氧 免疫原性
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,SS2）是一种重要的人畜共患病原菌,可引起人的中毒性休克综合症和死亡,引起猪的脑膜炎、心内膜炎、败血症、关节炎、浆膜炎和肺炎,是猪的一种重要细菌性传染病,给养猪业造成重大的经济损失。荚膜多糖（CPS）、溶菌酶释放蛋白（MRP）、细胞外蛋白因子（EF）、溶血素和黏附素等是SS2的重要的毒力因子,但这些毒力因子并不能完全解释SS2的致病机理。广义的毒力因子应该包括那些与体内外环境应答有关的所有因子。所谓的环境应答即病原菌在感染过程中受到温度、渗透压、氧、pH及营养物质利用率等条件影响时所产生的变化。这些感染相关因子的鉴定与表达调控的研究,不仅有利于病原菌致病机理的解析,而且对疫苗、药物和诊断技术的设计与研制具有重要的指导意义。本研究运用转录序列选择性捕获（selective capture oftranscribed sequences,SCOTS）技术鉴定出SS2在高温、厌氧和感染猪脑组织中上调表达的基因,并对其中几种SS2细胞壁蛋白的免疫原性进行了研究,现将主要研究结果报告如下:1.猪链球菌2型在感染猪脑组织中上调表达基因的鉴定以1.5×105 CFUSS2 SC-19株鼻内接种5头健康仔猪,72h后采集感染猪的脑组织,提取总RNA,同时提取体外培养的SS2的总RNA,运用SCOTS技术进行六轮筛选,获得SS2在感染猪脑组织中的上调表达的基因71个。DNA序列分析结果表明,这些包括如下6类:与新陈代谢有关的有30个基因;与细胞壁有关的有12个基因;与复制有关的有9个基因;与蛋白有关的有3个基因;与转录有关的有9个基因;另外有8个功能尚不清楚。2.热应激和厌氧对猪链球菌2型的基因表达调控热应激与厌氧是两种很重要的环境信号,对病原菌的基因表达发挥重要的调控作用。本实验中,以常规体外培养条件为对照,用SCOTS技术筛选出SS2在高温条件下上调表达的基因33个、在厌氧条件下上调表达的基因21个,为SS2在应激条件下的基因表达调控的深入研究奠定了基础。3.体内诱导的猪链球菌2型胞壁蛋白的免疫原性研究从感染猪脑组织中筛选出的71个上调表达的基因中筛选出4个编码细胞壁相关蛋白的基因,进行了克隆表达和蛋白质纯化。将纯化的重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后免疫小鼠2次后,分别用2×LD50和5×LD50的SS2强毒株攻击。试验结果表明,4种重组蛋白均能诱导小鼠产生高滴度的抗体;在使用2×LD50的攻毒剂量时,4种重组蛋白免疫的小鼠都可以保护,但在使用5×LD50的攻毒剂量时,只有Hp0254和Hp1311N具有较好的保护力,可作为候选疫苗抗原。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略语表(Abbreviation)  11-14
第一章 文献综述  14-38
  1.1 猪链球菌2型与细菌性脑炎  14-24
    1.1.1 细菌性脑炎  14-17
    1.1.2 猪链球菌2型  17-24
  1.2 细菌的厌氧应激调控  24-26
  1.3 细菌的热应激调控  26-30
  1.4 病原菌体内诱导基因  30-38
    1.4.1 体内诱导基因的意义  30
    1.4.2 内诱导基因的筛选方法  30-38
第二章 猪链球菌2型在高温、厌氧和感染猪脑组织表达上调基因的鉴定  38-74
  2.1 研究目的及意义  38
  2.2 材料和方法  38-48
    2.2.1 主要药品及试剂  38
    2.2.2 培养基与抗生素及其配制  38-39
    2.2.3 主要缓冲液  39-40
    2.2.4 菌株、质粒及培养条件  40-41
    2.2.5 实验动物与动物感染  41
    2.2.6 本研究所用引物  41-42
    2.2.7 质粒的小量制备  42
    2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备  42
    2.2.9 猪2型链球菌基因组DNA的制备  42
    2.2.10 rRNA基因的克隆  42-44
    2.2.11 猪2型链球菌RNA的提取及RT-PCR  44-45
    2.2.12 SCOTS  45-47
    2.2.13 Southern Dot Blot  47-48
    2.2.14 基因测序与功能注释  48
  2.3 结果与分析  48-67
    2.3.1 猪链球菌2型16S rRNA与23S rRNA基因的克隆与序列分析  48-50
    2.3.2 猪链球菌2型在高温、厌氧表达上调基因的鉴定  50-59
    2.3.3 猪链球菌2型在感染脑组织表达上调基因的鉴定  59-67
  2.4 讨论  67-74
第三章 猪2型链球菌候选保护性抗原的研究  74-90
  3.1 研究目的及意义  74
  3.2 材料与方法  74-84
    3.2.1 主要试剂  74-75
    3.2.2 主要缓冲液  75-77
    3.2.3 菌株与培养条件  77
    3.2.4 本实验所用引物  77
    3.2.5 实验动物  77-78
    3.2.6 pET-28a表达载体  78
    3.2.7 猪2型链球菌基因组DNA的制备  78-79
    3.2.8 疫苗候选蛋白的克隆表达及纯化  79-82
    3.2.9 小鼠感染试验  82-83
    3.2.10 小鼠免疫  83
    3.2.11 小鼠免疫效力试验  83
    3.2.12 小鼠抗体水平评价  83-84
  3.3 结果与分析  84-89
    3.3.1 免疫原性蛋白的重组表达纯化  84-85
    3.3.2 小鼠感染试验  85
    3.3.3 小鼠抗体水平评价  85-88
    3.3.4 蛋白对小鼠免疫效力试验  88-89
  3.4 讨论与结论  89-90
小结与展望  90-91
参考文献  91-100
致谢  100

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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