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小儿肾病综合征ox-LDL脂质肾损伤及肾康灵干预的机制研究

作　者: 艾斯
导　师: 郑健
学　校: 福建中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 原发性肾病综合征 肾康灵 氧化低密度脂蛋白 MAPK通路 CXCL16/CXCR6
分类号: R272
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：体外实验以氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)诱导系膜细胞(mesangial cells,MCs)增殖,观察其分泌CXCL16、CD36、解聚素与金属蛋白酶10(a disintegrin and metalloprotease10, ADAM10)、ADAM17的水平以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路相关蛋白的磷酸化水平；体内实验以阿霉素肾病(adriamycin nephropathy,AN)大鼠为研究对象,观察其肾组织的CXCL16、CD36、 ADAM10、ADAM17水平及MAPK信号通路相关蛋白的活性,阐明脂质对肾损伤的作用机制。同时应用益肾活血中药肾康灵进行干预,观察治疗前后CXCL16、CD36、ADAM10、 ADAM17及MAPK信号通路相关蛋白的变化,从分子生物学及基因学水平进一步阐明益肾活血中药肾康灵干预PNS的作用机制,为提高小儿PNS的临床疗效和益肾活血法的临床应用奠定基础。方法：(1)基础研究：体外实验将MCs按随机数表法分为7组：①正常对照组；②ox-LDL组：③ox-LDL+CXCR6组：④ox-LDL+肾康灵低浓度组；⑤ox-LDL+1肾康灵高浓度组；⑥ox-LDL+阿托伐他汀低浓度组；⑦ox-LDL+阿托伐他汀高浓度组。采用MTT比色法测定MCs的增殖比率；分别采用ELISA法检测MCs的CXCL16、CD36、IFN-γ、IL-6、TNF-α含量,Real Time-PCR、Western blot法检测MCs的CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17的基因水平及其蛋白含量。采用Western Blot方法检测MAPK通路相关蛋白(p38、JNK、 ERK)及核因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)的磷酸化水平。体内实验将大鼠按体质量分层随机法分为5组：①正常组；②AN病模组；③肾康灵(低浓度)+西药组15只；④肾康灵(高浓度)+西药组；⑤西药组。各组连续灌胃22d。灌胃结束后,分别采用Real Time-PCR、Western blot法检测大鼠肾组织的CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17的基因水平及其蛋白含量,并检测尿蛋白定量及血白蛋白(albumin,ALB)、胆固醇(cholesterol,CH)水平,通过HE染色,电镜观察并分析肾组织病理形态学。(2)临床研究：PNS患儿采用随机数表法分为肾康灵+西药组和西药组,同时在体检中心抽取健康体检儿童为健康对照组。采用ELISA法检测PNS患儿治疗前后血清CXCL16、 ADAM10、ADAM17的分泌变化,同时检测血ALB、CH、24小时尿蛋白定量等以进行疗效评价。结果：(1)基础研究：体外实验表明利用ox-LDL诱导大鼠系膜细胞增殖后,其表面CXCL16、 CD36、IFN-γ、IL6、TNF-α的表达显著升高(P<0.01),加入CXCR6受体后,其表达水平进一步升高(P<0.01),肾康灵含药血清组呈浓度依赖性降低上述指标(P<0.01); ox-LDL诱导大鼠系膜细胞增殖后,CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17的基因水平和蛋白含量显著升高(P<0.01),加入CXCR6受体后,其基因水平和蛋白含量进一步升高(P<0.01),肾康灵含药血清组呈浓度依赖性降低上述指标(P<0.01或P<0.05); ox-LDL诱导大鼠系膜细胞增殖后,MCs表面的p38、ERK1/2、SAPK/JNK、NF-κ Bp65的磷酸化水平显著升高(P<0.01),加入CXCR6受体后,其磷酸化水平进一步升高(P<0.01),肾康灵含药血清组呈浓度依赖性降低ERK1/2、SAPK/JNK、NF-κ B p65的磷酸化水平(P<0.01)。体内实验表明AN大鼠的尿蛋白定量升高、血清ALB降低、CH升高、肾组织的CXCL16、CD36、 ADAM10、ADAM17的基因水平和蛋白含量升高,p38、ERK1/2、SAPK/JNK、NF-κ B p65的磷酸化水平升高(P<0.01),肾康灵+西药松组呈浓度依赖性降低CXCL16、CD36、 ADAM10、ADAM17的表达,降低p38、ERK1/2、SAPK/JNK、NF-κ Bp65的磷酸化水平(P<0.01)；肾康灵(高、低浓度)+西药组的CH水平与西药组相比显著降低(P<0.01或P<0.05)。(2)临床研究表明,PNS患儿的尿蛋白定量升高、血清ALB降低、CH升高、CXCL16、 ADAM10、ADAM17的含量升高(P<0.01),肾康灵+西药治疗组在降低尿蛋白定量、CH及血清CXCL16、ADAM10、ADAM17的含量方面明显优于西药组(P<0.01或P<0.05)。结论：(1)ox-LDL可促使系膜细胞释放CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17等炎症介质,CXCR6可介导这一途径。ox-LDL激活了MAPK信号转导通路,使p38、ERK1/2、 SAPK/JNK的磷酸化水平升高,激活了NF-κ Bp65的活性,CXCR6-CXCL16介导MAPK信号途径。(2)益肾活血中药肾康灵通过降低CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17等炎症介质的释放及抑制MAPK信号转导通路的激活,从而抑制系膜细胞的增殖,降低尿蛋白、CH水平,有效地改善AN大鼠的病理损伤和PNS患儿的临床症状。

全文目录


中文摘要  7-10
Abstract  10-13
英文縮略词表  13-14
前言  14-17
第一部分 肾康灵含药血清干预氧化低密度脂蛋白诱导的肾小球系膜细胞增殖的实验研究  17-38
  1. 研究目的  17
  2. 实验材料  17-18
  3. 实验方法与步骤  18-22
    3.1 肾康灵含药血清的制备  18
    3.2 含药血清高效液相色谱的检测  18
    3.3 系膜细胞的培养  18
    3.4 MTT比色试验  18
    3.5 实验分组  18-19
    3.6 ELISA法检测系膜细胞CXCL16、CD36、IFN-γ、IL6、TNF-α水平  19
    3.7 real-time PCR法检测系膜细胞CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17基因水平  19-21
    3.8 Western blot法检测系膜细胞CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17蛋白含量及MAPK信号转导通路相关蛋白的磷酸化水平  21
    3.9 统计学处理  21-22
  4. 结果  22-33
    4.1 肾康灵含药血清的测定  22-23
    4.2 ox-LDL诱导大鼠系膜细胞增殖的形态观察  23
    4.3 ox-LDL诱导大鼠系膜细胞的增殖曲线  23-24
    4.4 ELISA法检测系膜细胞表面的CXCL16、CD36的含量  24-25
    4.5 ELISA法检测系膜细胞表面的IFN-γ、IL6、TNF-α的含量  25-26
    4.6 real-time PCR 结果  26-28
    4.7 CXCL16与ADAM10、ADAM17基因水平的相关性分析  28
    4.8 Western Blot法检测系膜细胞表面CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17蛋白含量  28-30
    4.9 CXCL16与ADAM10、ADAM17蛋白含量的相关性分析  30
    4.10 ox-LDL对系膜细胞信号通路的功能影响及肾康灵的干预作用  30-33
  5. 小结  33
  6. 讨论  33-38
第二部分 肾康灵干预阿霉素肾病大鼠的实验研究  38-52
  1. 研究目的  38
  2. 实验材料  38
  3. 实验方法与步骤  38-42
    3.1 实验分组  38
    3.2 复制AN模型  38-39
    3.3 给药方法  39
    3.4 24h尿蛋白定量检测  39
    3.5 血液生化指标检测  39
    3.6 real time-PCR 法  39-40
    3.7 Western blot 法  40-41
    3.8 肾脏形态学检查  41-42
    3.9 统计学处理  42
  4. 结果  42-48
    4.1 一般情况  42
    4.2 造模成功  42
    4.3 采用4%横柳酸法检测24 h尿蛋白定量  42-43
    4.4 采用全自动生化分析仪测定大鼠的ALB、CH水平  43-44
    4.5 real-time PCR法检测肾组织CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17基因水平结果  44-45
    4.6 Western blot法检测肾组织CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17蛋白含量结果  45
    4.7 Western blot法检测大鼠肾组织MAPK信号转导通路相关蛋白的磷酸化水平  45-46
    4.8大鼠肾脏病理形态学表现  46-48
  5. 小结  48-49
  6. 讨论  49-52
第三部分 肾康灵干预原发性肾病综合征患儿的临床研究  52-72
  1. 研究目的  52
  2. 临床资料  52-53
  3. 研究方法  53-54
    3.1 治疗方法  53
    3.2 指标检测  53-54
    3.3 统计方法  54
  4. 结果  54-56
    4.1 24 h尿蛋白定量结果  54
    4.2 PNS患儿ALB、CH水平  54-55
    4.3 PNS患儿血清CXCL16、ADAM10, ADAM17的含量  55-56
  5. 小结  56
  6. 讨论  56-72
结论  72-73
参考文献  73-78
致谢  78-79
文献综述  79-84
  参考文献  82-84
作者简历  84-85

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中医儿科
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