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缺锌上调儿童PBMCs的ZIP2表达及ZIP2对淋巴细胞Jurkat，E6-1分泌IFN-γ的影响

作　者: 陶艳亭
导　师: 张莲英
学　校: 山东大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 锌 锌转运体 Jurkat E6-1 低锌 基因表达
分类号: R153.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景：锌是生物体所必须的微量元素之一,人体内300多种酶和转录因子的重要组成成分,起着稳定结构、催化和调节的作用。在世界范围内,因缺锌引起的疾病发生率估计超过20%,在发展中国家锌缺乏症可能影响到了二十多亿人的健康。锌缺乏症的发生主要是由于营养不良、衰老和天生的或是获得性锌吸收障碍所导致的,而缺锌主要会导致胸腺萎缩,免疫功能障碍,感染性疾病发病率增高并伴随着着生长迟缓和内分泌功能障碍。在临床上,补锌可能是辅助治疗由缺锌引起的疾病的有效的措施之一,尤其是易感人群中儿童和老人。在细胞免疫和体液免疫中,锌离子是必不可少的,缺锌会导致免疫功能紊乱,包括损伤细胞的固有免疫调节,锌在免疫系统的功能上广泛研究。体内锌平衡是通过胃肠道高度调节,但这种紧密的调节需要多种锌转运体相互协调作用。哺乳动物中,两大锌转运体基因家族参与锌在细胞内外的转运：ZIP和ZnT。由于两锌转运体基因家族在锌转运功能方面表现出相反的作用,因此锌转运体在维持细胞内外锌平衡中起到至关重要的作用。近年来研究发现,ZIP2蛋白可能与人的免疫力相关,尤其是在低锌的条件下。在ZIP2基因敲除鼠中,对野生型和基因敲除鼠进行基因表达分析,发现ZIP2在免疫系统的一些未成熟的树突状细胞中活跃表达；幼儿过敏性哮喘患者血清锌明显低于正常水平,且外周血单个核细胞(PBMCs)中ZIP2mRNA量显著高于正常人。提示ZIP2在免疫细胞中发挥一定的作用。因此,探讨在免疫细胞缺锌与ZIP2的表达水平的关系。研究目的：体内外探讨缺锌对儿童PBMCs中ZIP2表达的影响。将已构建成功的ZIP2表达载体转染人T淋巴细胞Jurkat, E6-1细胞株,研究ZIP2对Jurkat, E6-1细胞分泌细胞因子的影响。实验方法：一、临床收集20例缺锌患儿以及20例正常对照儿童和不同年龄段的正常人的抗凝外周血液样本、原子吸收分光光度计检测血清锌含量、密度梯度离心法分离样本的PBMCs,通过Real-time PCR方法检测PBMCSS锌转运体ZIP2、ZIP1、 ZIP6、ZnT1mRNA表达。体外培养正常儿童的外周血单个核细胞,TPEN处理,每周检测ZIP2的表达,至第七周,探讨PBMCs体外长时间缺锌条件下对ZIP2的影响；不同浓度的TPEN处理Jurkat, E6-1细胞株12h,选择一合适的TPEN浓度。二、将已构建完成的pEGFP-N1-ZIP2真核表达载体转染至人T淋巴细胞。转染36h后,TPEN处理12h转染48h后,Real-time PCR和Western-blot技术检测淋巴细胞中ZIP2mRNA和蛋白质的表达水平,然后采用Real-time PCR技术检测ZIP2过表达对其他锌转运体ZIP1、ZnT1、ZnT5、ZIP6、ZIP10及细胞因子INF-y和IL-6mRNA水平产生的影响；通过MTT比色法检测ZIP2对细胞增殖的影响。实验结果：一、低锌患儿组与正常对照儿童相比,Real-time PCR结果显示低锌患儿PBMCs中ZIP2的表达量明显高于正常对照组(P<0.05)；低锌患儿中,ZnTl表达量上调,ZIPl的表达量下调,而ZIP6的表达没有显著差异。不同年龄的成年人与正常儿童比,青年组中ZIP2的表达最低。体外培养的正常儿童外周血细胞,结果显示,ZIP2的表达下降后上调的。二、ZIP2真核表达载体pEGFP-N1-ZIP2转染至Jurkat, E6-1细胞株后,结果显示ZIP2在Jurkat, E6-1细胞株内高表达,ZnT1mRNA表达量下调(P<0.05)而其他锌转运体ZIP1、ZnT5、ZIP6、ZIP10mRNA表达量均没有显著改变(P>0.05)；细胞因子INF-y的mRNA表达量上调(P<0.05),TPEN处理后,INF-y的mRNA表达量下调(P<0.05),而IL-6的表达量没有明显改变(P>0.05),且对细胞的增殖没有显著影响(P>0.05)。结论：本研究在体内外检测了缺锌时儿童PBMCs中ZIP2的表达,结果显示缺锌上调儿童的PBMCs中ZIP2的表达,缺锌处理细胞株Jurkat, E6-1,使ZIP2表达上调,推测在缺锌状态下ZIP2在维持锌的动态平衡和免疫调节过程中起一定作用。同时,将ZIP2真核表达载体pEGFP-N1-ZIP2成功转染至Jurkat, E6-1细胞株中,观察细胞株中细胞因子的分泌情况,结果发现ZIP2高表达可使细胞因子INF-y的表达上调,IL-6的表达没有显著改变,提示ZIP2可能在淋巴细胞中扮演重要的角色。

全文目录


摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
符号说明  13-15
前言  15-19
材料和设备  19-22
实验方法  22-34
结果  34-46
讨论  46-51
参考文献  51-57
致谢  57-58
攻读学位期间发表的学术论文  58-59
学位论文评阅及答辩情况表  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 营养卫生、食品卫生 > 各类型人群的营养 > 儿童、少年营养
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