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刺参（Apostichopus japonicus Selenka）养殖池塘生态系统微生物结构与功能研究

作　者: 闫法军
导　师: 董双林; 田相利
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 微生物群落结构特征功能多样性生长免疫 PCR-DGGE BIOLOG 冗余分析
分类号: S968.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

刺参（Apostichopus japonicus Selenka）养殖业是我国特色海水养殖产业之一，主要分布在辽宁和山东沿海。刺参养殖业发展迅速，2010年全国刺参养殖面积已达到16万公顷，产量达13万吨，产值接近200亿元。然而，相对于其迅速发展的规模，与刺参养殖技术相关的基础研究还比较滞后。目前，在刺参的养殖生产实践中，微生物修复技术已越来越受到人们的重视。微生物修复作用的强弱与养殖环境中微生物群落的生态结构与功能特征密切相关，反之，微生物群落的生态结构与功能特征能够反映环境的健康状况。因此，了解刺参养殖池塘环境微生物群落的结构和功能特征具有十分重要的意义。本研究采用PCR-DGGE指纹图谱技术和BIOLOG-ECO微平板培养法，研究了刺参养殖池塘水体、底泥和附着基沉积物中的微生物群落结构和功能以及它们与环境因子间的相互关系；另外，对几株前期分离筛选自刺参池塘环境中的潜在益生菌进行了饲喂刺参实验以探讨它们对刺参生长和免疫提高方面的功能作用。本研究旨在为刺参池塘环境微生态调控模式的建立提供基础资料。主要研究结果如下：1刺参池塘环境微生物群落结构的季节变化利用PCR-DGGE技术和冗余分析（RDA）方法研究了刺参（Apostichopusjaponicus）养殖池塘环境（水体、底泥、附着基）细菌微生物群落结构的季节变化及其与环境因子间的关系。结果表明：（1）刺参养殖水体中的优势菌群归属于α-Proteobacteria、 γ-Proteobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria及一部分未知不可培养菌群（uncultured bacteria）。变形菌纲细菌（Proteobacteria）为各季节水体中的绝对优势菌群，其相对丰度在49.3-72.1%之间，其中以α-Proteobacteria含量最高；Cyanobacteria仅出现在秋季水体中，其丰度颇低。显著性方差分析结果发现， γ-Proteobacteria菌群丰度具有显著的季节变化。比较而言，水体细菌群落结构以秋季最复杂，冬季最简单。（2）底泥中的优势菌群归属于α-Proteobacteria、 γ-Proteobacteria、 δ-Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflex、Actinobacteria和Sphingobacteria。变形菌纲细菌为各季节底泥中的绝对优势菌群，其相对丰度在49.6-55.1%之间，其中又以γ-Proteobacteria含量占绝对优势；Chloroflex菌群仅出现在春、秋季节样品中，且春季丰度较高；Actinobacteria菌群在春季样品中未检测到。显著性方差分析发现，Actinobacteria菌群丰度在夏季显著高于冬季。比较而言，底泥细菌群落结构以秋季最复杂。（3）附着基中的优势菌群归属于α-Proteobacteria、 γ-Proteobacteria、 δ-Proteobacteria、ε-Proteobacteria、Flavobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Actinobacteria及uncultured bacteria。变形菌纲为各季节附着基中的绝对优势菌群，其相对丰度在54.6-60.2%之间，其中以α-Proteobacteria、-Proteobacteria含量最高；Flavobacteria相对丰度亦颇高，其中在春、夏季节含量仅次于α-Proteobacteria；Cyanobacteria在春季样品中未检测到，Actinobacteria在夏季样品中未检测到。显著性分析结果表明， γ-Proteobacteria、 ε-Proteobacteria和Flavobacteria3类菌群含量具有显著季节变化。附着基细菌群落结构在秋、冬季较春、夏季复杂。（4）RDA分析发现，T、TN、NO₃^-N、PO₄^-P和NO₂^-N是影响水体细菌群落结构季节变化的主要环境因子，PO₄^-P、NH4^-N、NO₃^-N和TP是影响底泥细菌群落结构季节变化的主要环境因子，TP、TN、TOC、SOM和NO₃^-N是影响附着基细菌群落结构季节变化的主要环境因子。本研究结论认为，刺参池塘水体、底泥和附着基细菌群落结构具有明显的不同的季节变化，相对而言，底泥菌群结构较水体和附着基稳定；水体、底泥和附着基菌群结构组成存在明显差异，其中以附着基菌群结构最复杂，生物多样性最丰富，水体中最简单；刺参池塘水体、底泥和附着基细菌群落结构季节变化与环境因子具有很好的相关性。2刺参池塘环境微生物群落功能多样性的季节变化利用BIOLOG技术和冗余分析（RDA）方法对刺参（Apostichopus japonicus）养殖池塘环境（水体、底泥、附着基）微生物群落功能多样性的季节变化及其与环境因子间的关系进行了研究。结果表明：（1）刺参池塘水体、底泥和附着基微生物对碳源总量和单类碳源的利用均具有显著的季节变化，总体表现为春、夏、秋季节高于冬季，其中水体微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物，底泥微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物、糖类、羧酸和氨基酸，附着基微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物、糖类、氨基酸和胺。（2）主成分分析表明，刺参池塘水体、底泥和附着基微生物碳代谢方式均具有显著的季节变化。水体中，与主成分显著相关的碳源有15种，其中与主成分1显著相关的碳源主要有10种，分别属于聚合物、糖类、羧酸、氨基酸和胺；底泥中，与主成分显著相关的碳源有18种，其中与主成分1显著相关的主要有13种，分别属于糖类、羧酸和氨基酸；附着基中，与主成分显著相关的碳源有22种，其中与主成分1显著相关的主要有20种，分别属于聚合物、糖类、羧酸和氨基酸。（3）刺参池塘水体、底泥和附着基微生物多样性指数Shannon、McIntosh、Simpson和S-E均匀度均存在显著的季节变化，但不同指数之间的变化有较大差异。（4）RDA分析表明，TP、NO₃^-N、TN和PO₄^-P是影响刺参池塘水体微生物群落功能多样性季节变化的主要因素；TP、NO₃^-N和PO₄^-P是影响底泥微生物功能多样性季节变化的主要因素；SOM、NO₃^-N和TN是影响附着基微生物功能多样性季节变化的主要因素。结论认为，刺参池塘水体、底泥和附着基微生物功能多样性具有显著的不同的季节变化，这些变化与环境因子具有很好的相关性。3刺参池塘不同类型附着基微生物群落结构研究利用PCR-DGGE技术和冗余分析（RDA）方法研究了刺参（Apostichopusjaponicus）养殖池塘不同类型附着基（瓦片、网笼、塑料管）细菌微生物群落结构特征及其与环境因子间的关系。结果表明：（1）瓦片与网笼附着基中的优势菌群群落组成相同，均归属于α-Proteobacteria、 γ-Proteobacteria、Sphingobacteria、Chloroflex、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Flavobacteria；而塑料管附着基中的优势菌群归属于α-Proteobacteria、 γ-Proteobacteria、Sphingobacteria、Chloroflex、Bacteroidetes、Actinobacteria、Flavobacteria。（2）黄杆菌纲细菌（Flavobacteria）为各附着基样品中的绝对优势菌群，其相对丰度均在45%以上，但在不同类型附着基之间无显著差异。变形菌纲（Proteobacteria）为各附着基中的第二大优势菌群，其相对丰度在瓦片中最低（20.7%），网笼中最高（34.7%），其中瓦片和塑料管中以γ-Proteobacteria占优势，网笼中以α-Proteobacteria占优势；显著性方差分析表明，变形菌纲相对丰度在不同类型附着基中具有显著差异，其中α-Proteobacteria在网笼中丰度（16.2%）显著高于瓦片（9.5%）和塑料管（6.4%），γ-Proteobacteria在塑料管中丰度（28.3%）显著高于瓦片（11.2%）和网笼（13.2%）。拟杆菌纲（Bacteroidetes）相对丰度在瓦片、网笼和塑料管中依次降低，其在瓦片中的含量（6.0%）显著高于塑料管（0.4%）；蓝藻纲（Cyanobacteria）细菌丰度（在塑料管中未检测到）在各附着基中的变化趋势与拟杆菌纲相同。Actinobacteria仅出现在塑料管附着基样品中。Sphingobacteria和Chloroflex相对丰度在不同附着基之间无显著差异。（3）RDA分析发现，TN、PO₄^-P、NO₃^-N和NH₄^-N是不同类型附着基细菌群落结构差异的主要影响环境因子。本研究结论认为，刺参池塘瓦片、网笼和塑料管附着基细菌群落结构不同，比较而言，瓦片和网笼附着基细菌群落结构特征最相似，而塑料管附着基中的菌群结构与瓦片和网笼中差异较大；刺参池塘瓦片、网笼和塑料管附着基细菌群落结构特征与环境因子具有很好的相关性。4刺参池塘不同类型附着基微生物群落功能多样性研究利用BIOLOG技术和冗余分析（RDA）方法对刺参（Apostichopus japonicus）养殖池塘不同类型附着基（瓦片、网笼、塑料管）微生物群落功能多样性及其与环境因子间的关系进行了研究。结果表明：（1）瓦片、网笼和塑料管附着基微生物对碳源总量和单类碳源的利用均具有明显差异，总体表现为塑料管>网笼>瓦片，其中塑料管和网笼附着基微生物对单类碳源的代谢强度均显著高于瓦片；塑料管附着基微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物、糖类和氨基酸，网笼附着基微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物、糖类和羧酸，瓦片附着基微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物和羧酸。（2）主成分分析表明，瓦片、网笼和塑料管附着基微生物碳代谢方式均具有显著差异，这种差异主要体现在主成分1上；与主成分1显著相关的碳源有13种，分别属于聚合物（3种）、糖类（4种）、氨基酸（4种）、羧酸（1种）和胺（1种）。（3）瓦片、网笼和塑料管附着基微生物碳代谢多样性指数McIntosh和Simpson均存在显著差异，其中McIntosh指数在网笼和塑料管中显著高于瓦片，Simpson指数在塑料管中显著高于瓦片；而Shannon和S-E均匀度均无显著差异。（4）RDA分析表明，TN、PO₄^-P和NO₃^-N是不同类型附着基微生物功能多样性差异的主要影响环境因子。结论认为，刺参池塘瓦片、网笼和塑料管不同类型附着基微生物功能多样性具有显著的不同，这些差异与环境因子具有很好的相关性。5饲料中添加潜在益生菌对刺参生长和非特异性免疫酶活性的影响研究了饲喂1株马氏副球菌（Paracoccus marccui DB11）和1株芽孢杆菌（Bacillus baekryungensis YD13）对刺参（Apostichopus japonicus）生长和非特异性免疫酶活性的影响。将DB11或YD13分别以3个添加浓度水平（110⁴、110⁶和110⁸cfu/g）添加于基础饲料中饲喂刺参（初始体质量（5.340.11）g）60d（以基础饲料饲喂组为对照），试验它们对刺参生长和刺参不同体组织中非特异性免疫酶活性的影响。生长实验结果表明：与对照相比，饲料中添加110⁸cfu/g DB11、110⁴或110⁶cfu/g YD13均能显著提高刺参的增重率和特定生长率（P<0.05）。免疫实验结果表明：DB11在110⁸cfu/g高浓度下对刺参各体组织免疫酶活有最大提高作用，而YD13在110⁶cfu/g较低浓度下具有更好的酶活提高作用；刺参不同体组织的免疫酶活反应强度不同，表现为体腔液>呼吸树>肠道>体壁，因此体腔液对刺参的免疫功能起着非常重要的作用。结论认为，本研究的2株细菌具有提高刺参生长和免疫功能的潜力，因此在刺参养殖方面具有较好的应用前景。

全文目录

摘要  5-10
Abstract  10-21
引言  21-22
第一部分（章）文献综述  22-28
  1.1 微生物生态及其与水产养殖的关系  22-26
    1.1.1 微生物生态学的概念  22
    1.1.2 微生物生态学的主要研究方法  22-25
    1.1.3 微生物生态与水产养殖  25-26
  1.2 刺参养殖业现状及主要存在问题  26
  1.3 本论文的立题依据和主要研究内容  26-28
第二部分刺参养殖池塘生态系统微生物群落结构与功能多样性的季节变化  28-70
  引言  28-30
  第二章刺参池塘环境微生物群落结构的季节变化  30-54
    2.1 材料与方法  30-33
      2.1.1 样品采集  30
      2.1.2 环境因子指标测定  30
      2.1.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析方法  30-33
        2.1.3.1 样品总 DNA 的提取  30-31
        2.1.3.2 16S rDNA V3 区基因 PCR 扩增  31-32
        2.1.3.3 变性梯度凝胶的制作  32
        2.1.3.4 DGGE 条带的切割和扩增  32-33
        2.1.3.5 DGGE 优势条带的克隆测序  33
      2.1.4 数据处理和分析  33
    2.2 结果  33-50
      2.2.1 刺参池塘环境因子指标的季节变化  33-35
      2.2.2 刺参池塘水体环境微生物群落结构的季节变化  35-40
      2.2.3 刺参池塘底泥环境微生物群落结构的季节变化  40-45
      2.2.4 刺参池塘附着基环境微生物群落结构的季节变化  45-50
    2.3 讨论  50-54
      2.3.1 刺参养殖池塘环境微生物群落结构特征  50-51
      2.3.2 刺参养殖池塘环境微生物群落结构的季节变化与环境因子间的关系  51-54
  第三章刺参池塘环境微生物群落功能多样性的季节变化  54-70
    3.1 材料与方法  54-56
      3.1.1 样品采集方法  54
      3.1.2 环境因子指标测定  54
      3.1.3 微生物群落功能多样性测定  54-55
      3.1.4 数据处理  55-56
    3.2 结果  56-67
      3.2.1 刺参池塘环境微生物利用全部碳源的季节变化  56
      3.2.2 刺参池塘环境微生物对不同类型碳源利用的季节变化  56-58
      3.2.3 刺参池塘环境微生物碳源利用随季节变化的主成分分析  58-61
      3.2.4 刺参池塘环境微生物利用碳源的多样性指数随季节变化  61-63
      3.2.5 刺参池塘环境微生物碳代谢功能多样性与环境因子间的关系  63-67
    3.3 讨论  67-70
      3.3.1 刺参池塘环境微生物群落功能多样性的季节变化  67
      3.3.2 刺参池塘环境微生物群落功能多样性季节变化与环境因子间的关系  67-70
第三部分刺参池塘不同类型附着基微生物群落结构与功能多样性研究  70-89
  引言  70-71
  第四章刺参池塘不同类型附着基微生物群落结构研究  71-80
    4.1 材料与方法  71
      4.1.1 样品采集  71
      4.1.2 环境因子指标测定  71
      4.1.3 微生物群落结构测定  71
      4.1.4 数据处理  71
    4.2 结果  71-77
      4.2.1 刺参池塘不同类型附着基环境因子指标  71-72
      4.2.2 刺参池塘不同类型附着基微生物群落结构特征  72-77
    4.3 讨论  77-80
  第五章刺参池塘不同类型附着基微生物群落功能多样性研究  80-89
    5.1 材料与方法  80
      5.1.1 样品采集  80
      5.1.2 环境因子指标测定  80
      5.1.3 微生物群落功能多样性测定  80
      5.1.4 数据处理  80
    5.2 结果  80-86
      5.2.1 刺参池塘不同类型附着基环境因子指标  80
      5.2.2 刺参池塘不同类型附着基微生物对全部碳源的利用  80-81
      5.2.3 刺参池塘不同类型附着基微生物对不同类型碳源的利用  81-82
      5.2.4 刺参池塘不同类型附着基微生物碳源利用的主成分分析  82-84
      5.2.5 刺参池塘不同类型附着基微生物利用碳源的多样性指数  84-85
      5.2.6 刺参池塘不同类型附着基微生物碳代谢功能多样性与环境因子间的关系  85-86
    5.3 讨论  86-89
第四部分饲料中添加潜在益生菌对刺参生长和非特异性免疫酶活性影响研究  89-104
  第六章饲料中添加潜在益生菌对刺参生长和非特异性免疫酶活性的影响  89-104
    引言  89-90
    6.1 材料与方法  90-92
      6.1.1 实验材料  90
      6.1.2 实验设计  90
      6.1.3 菌株安全性检测  90-91
      6.1.4 饲养管理  91
      6.1.5 样品采集与指标测定  91-92
      6.1.6 计算与数据统计  92
    6.2 结果  92-99
      6.2.1 饲料中添加细菌 DB11 或 YD13 对刺参生长的影响  92-93
      6.2.2 饲料中添加细菌 DB11 对刺参不同组织免疫酶活的影响  93-96
      6.2.3 饲料中添加细菌 YD13 对刺参不同组织免疫酶活的影响  96-99
    6.3 讨论  99-104
      6.3.1 饲料中添加潜在益生菌对刺参生长的影响  99-100
      6.3.2 饲料中添加潜在益生菌对刺参不同组织非特异性免疫酶活的影响  100-104
参考文献  104-112
致谢  112-113
个人简历  113
博士期间完成学术论文  113-114

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