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泛素化与类泛素（SUMO）化在甲壳动物免疫反应中的功能

作　者: 陈安静
导　师: 王金星
学　校: 山东大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 中国明对虾 克氏原螯虾 白斑综合征病毒 泛素化 SUMO化 泛素结合酶
分类号: S945
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


甲壳动物养殖业是我国重要的出口创汇产业。然而,自1992年白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)病的爆发,给我国乃至世界的水产养殖带来巨大的经济损失。因此,对参与病毒感染和复制的宿主蛋白进行鉴定和功能分析,对预防和控制病毒性疾病有重要的意义。泛素化和SUMO化都需要激活酶E1,结合酶E2和连接酶E3的参与,从而对靶蛋白进行特异性修饰。尽管类泛素SUMO的三维结构和酶促反应过程与泛素非常形似,但两类蛋白修饰的生物学意义却迥然不同。本研究选择对虾泛素结合酶和小龙虾SUMO结合酶,分别研究他们介导的泛素化和SUMO化在病毒感染和复制中的功能,进而阐明甲壳动物与白斑病毒相互作用的分子机理。1.中国明对虾泛素结合酶E2(FcUbc)介导白斑综合征病毒含有RING结构域蛋白的泛素化,并抑制病毒的复制我们从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了一个泛素结合酶E2,命名为FcUbc。FcUbc的cDNA全长967bp,其中开放阅读框447bp,编码148个氨基酸,包含一个泛素结合酶E2催化结构域(UBCc)。FcUbc特异性的分布于对虾肝胰腺和小肠中,在受到白斑病毒刺激后,都呈现出上调表达的趋势。在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组表达并纯化了FcUbc,用重组蛋白制备的多克隆抗体进行免疫组化分析,结果显示内源FcUbc蛋白定位于肝胰腺的B细胞和小肠的上皮细胞。为了研究其功能,除了重组表达FcUbc外,我们对FcUbc的催化活性位点进行了突变,重组表达了其突变体mFcUbc。利用FcUbc重组蛋白注射对虾,明显降低了染毒对虾的死亡率,并且大大抑制白斑病毒的复制。我们利用体外pull-down实验证实重组FcUbc能够结合病毒的四个含有RING结构域的蛋白(WRD1-4),后者被报道具有潜在的E3连接酶的功能,而突变体mFcUbc丧失了这样的体外结合能力。更重要的是,体外泛素化实验和果蝇S2细胞系(Drosophila melanogaster Schneider2)上的实验都证实了FcUbc介导了WSSV277和WSSV304的RING结构域的泛素化。在感染WSSV的果蝇S2细胞中,过表达的FcUbc增强了病毒WSSV277和WSSV304蛋白的泛素化。以上结果表明中国明对虾FcUbc介导白斑病毒含RING结构域蛋白的泛素化,并最终抑制病毒的复制。2.克氏原螯虾SUMO结合酶(UBC9)介导白斑综合征病毒极早期蛋白的SUMO化修饰并最终促进病毒复制我们从克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中克隆得到了小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier, SUMO)和SUMO结合酶UBC9。UBC9cDNA全长912bp,开放阅读框483bp,编码160个氨基酸,含有一个UBCc催化结构域,活性位点是位于93位的保守的半胱氨酸。SUMO cDNA全长960bp,开放阅读框282bp,编码93个氨基酸,含有一个泛素样结构域(UBQ),其活性位点是位于C末端的双甘氨酸残基。序列比对和进化树分析显示UBC9和SUMO进化上高度保守,小龙虾的UBC9和SUMO与酵母和人类的蛋白表现出极高的相似性。UBC9和SUMO组成型的存在于小龙虾各组织,在白斑病毒刺激后呈现上调表达。我们在大肠杆菌中重组表达并纯化了克氏原螯虾的UBC9、SUMO,突变体mUBC9和rnSUMO,及SUMO的活性形式SUMO-GG。向克氏原螯虾体内注射UBC9或SUMO重组蛋白增强了WSSV的基因复制,而突变体mUBC9和mSUMO则丧失此功能。接下来我们进一步分析了克氏原螯虾SUMO化系统促进白斑病毒复制的分子机理。克氏原螯虾UBC9蛋白体外结合WSSV三种极早期蛋白(IE, WSV051, WSV069和WSV187),其中只有WSV051能够被宿主UBC9介导发生SUMO化修饰。利用干扰降低小龙虾UBC9或SUMO的表达水平,导致病毒晚期基因表达被抑制,极早期基因表达也受到影响而表达量降低；并且这种抑制作用可以被注射的重组UBC9或SUMO解除,从而使感染的WSSV基因表达恢复正常状态。该研究表明小龙虾SUMO化系统被白斑病毒利用来修饰自身的极早期IE蛋白,这种修饰促进了病毒基因的转录和病毒复制。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
符号说明  11-13
第一章 泛素化与类泛素(SUMO)化在甲壳动物免疫中的功能  13-37
  一、甲壳动物疾病  13-18
    1. 研究意义  13-14
    2. 侵染甲壳动物的主要病原体  14-16
    3. 白斑综合征病毒研究概况  16-18
  二、泛素化与SUMO化  18-25
    1. 泛素化与SUMO化途径的组分  18-19
    2. 泛素化与SUMO化的反应过程  19-22
    3. 泛素化与SUMO化的功能  22-25
  三、泛素化途径与免疫  25-30
    1. 酵母中的泛素化  25-26
    2. 植物中泛素化与免疫反应  26-27
    3. 无脊椎动物的泛素化与发育和免疫  27-28
    4. 高等动物泛素化与免疫反应  28-29
    5. 病原微生物与宿主泛素化系统的相互作用  29-30
  四、病毒感染与宿主SUMO化修饰的关系  30-35
    1. 病毒蛋白与宿主SUMO化相互作用  32-33
    2. 病毒利用宿主SUMO化系统修饰自身蛋白  33-35
  五、研究目的和技术路线  35-37
第二章 对虾泛素结合酶E2(FcUbc)介导的泛素化抑制白斑综合征病毒复制  37-74
  一、引言  37-38
  二、材料和方法  38-52
    1. 试剂和仪器  38-39
    2. 实验材料和免疫刺激  39-40
    3. 菌株、载体和细胞系  40
    4. RNA提取和DNA合成  40-41
    5. FcUbc cDNA全长克隆  41-42
    6. 序列分析  42-43
    7. FcUbc mRNA水平表达模式  43
    8. 重组蛋白表达和纯化  43-47
    9. 多克隆抗体制备  47
    10. Western blot  47-48
    11.免疫组织化学  48
    12.对虾攻毒死亡率试验  48-49
    13.重组蛋白抗病毒活性试验  49
    14. 蛋白质pull-down实验  49
    15. 免疫细胞化学  49-50
    16. 体外泛素化实验  50
    17.果蝇S2细胞培养、传代、冻存和复苏  50-51
    18 果蝇S2细胞载体构建、转染和病毒感染  51-52
    19 免疫共沉淀检测蛋白相互作用  52
  三、结果  52-71
    1. FcUbc的cDNA序列克隆与分析  52-55
    2. FcUbc的组织分布和表达模式  55-56
    3 蛋白的重组表达与纯化  56-58
    4. FcUbc抗体检测内源蛋白的细胞定位  58-60
    5.重组FcUbc具有抗病毒活性  60-62
    6. pull-down实验证实FcUbc结合病毒RING结构域蛋白  62-63
    7.突变体mFcUbc丧失抗病毒能力，不能与WRD结合  63-65
    8 注射重组FcUbc能够进入血细胞  65-66
    9 FcUbc体外催化WSSV RING结构域蛋白泛素化  66-67
    10. S2细胞FcUbc介导WSSV RING结构域蛋白泛素化  67-68
    11.果蝇S2细胞支持WSSV基因复制和蛋白表达  68-70
    12. FcUbc介导感染S2的WSSV RING蛋白泛素化  70-71
  四、讨论  71-74
第三章 克氏原螯虾SUMO结合酶E2(PcUbc)介导SUMO化促进白斑结合症病毒复制  74-99
  一、引言  74-75
  二、材料和方法  75-81
    1.试剂和仪器  75
    2.菌株载体  75-76
    3. 实验材料和免疫刺激  76
    4. RNA提取和DNA合成  76
    5 FcUbc cDNA全长克隆  76
    6. 序列分析  76
    7 小龙虾UBC9和SUMO mRNA水平表达模式  76-77
    8. 重组蛋白表达和纯化  77-78
    9. 多克隆抗体制备  78
    10. Western blot  78
    1.1 注射重组蛋白与攻毒试验  78-79
    12. 蛋白质pull-down实验  79
    13. 体外SUMO化实验  79-80
    14. RNA干扰与攻毒试验  80-81
  三、结果  81-95
    1. 基因克隆与鉴定  81-83
    2. 序列分析  83-86
    3. 组织分布与病毒刺激后表达模式  86-87
    4. 重组蛋白表达与纯化  87-89
    5. 注射重组蛋白增强WSSV晚期基因表达  89-91
    6 克氏原螯虾UBC9体外结合WSSV IE蛋白  91-92
    7. UBC9介导WSV051体外SUMO化修饰  92-93
    8. 小龙虾UBC9和SUMO的RNA干扰  93
    9. UBC9或SUMO被干扰的龙虾中WSSV表达被抑制  93-94
    10. 干扰1}BO)或 SUMO 的小龙奸攻毒后再注射相应的被,干扰細的蛋白，WSSV 基因表达^导到恢M  94-95
  四、讨论  95-99
总结与创新点  99-100
参考文献  100-111
致谢  111-112
在读期间发表文章  112-113
学位论文评阅及答辩情况表  113

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治
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