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含白斑综合症病毒ie1启动子的表达载体的构建与应用研究

作　者: 牟毅
导　师: 王金星
学　校: 山东大学
专　业: 动物学
关键词: 白斑病毒 IE1启动子真核表达载体 C-型凝集素细菌清除克氏原螯虾
分类号: S945.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

白斑病对对虾水产养殖业造成巨大损失,其病原为白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)。在侵染宿主的过程中,其囊膜蛋白VP28起着关键作用。有报道重组表达的VP28或表达VP28的质粒具有明显的抗病毒作用；而囊膜蛋白VP19在有些研究中表明其有抗病毒作用,也有的研究显示其无抗病毒作用。为了深入了研究VP28的抗病毒功能,寻找一种有效地防治方法,并确定VP19的功能,我们构建了分别含WSSV的iel启动子和VP19或VP28的表达载体(pIevp28, pIevp28)。将载体分别注射克氏原螯虾后,通过实时定量PCR和蛋白质印迹等方法发现不同的质粒载体可以持续表达VP19或VP28,自第五天开始可以检测到较强的信号并持续至第三十天,同时在遭遇病毒的侵染之后,与对照组相比注射VP28质粒的螯虾感染病毒后死亡率明显下降,并且病毒在体内的复制被抑制。而VP19质粒虽然能够在螯虾体内转录,但不能抑制病毒的复制,死亡率与对照组亦无明显差异。免疫组织化学的结果显示VP28蛋白可以与血细胞的细胞膜结合,而VP19则不能。根据上述结果,我们认为VP28可能是能通过竞争性抑制的作用对螯虾进行保护。饲喂含有该质粒的大肠杆菌(E. coli)同样可以降低螯虾的死亡率。这或许可以作为一种新的防治白斑病毒的方法加以应用。而后我们考虑到该质粒是否可以用来表达螯虾蛋白以研究其功能,于是选择了来自克氏原螯虾的一种C-型凝集素来进行实验。C-型凝集素作为一种模式识别受体,在识别外来病原体侵染等方面起着非常重要的作用。在我们的研究中,从克氏原螯虾体内克隆到一种新型的C-型凝集素,称为PcLec4。PcLec4包括一个由17个氨基酸残基组成的信号肽和紧随其后的一个糖类识别结构域(carbohydrate recognition domain, CRD)。在螯虾受到白斑病毒或者鳗弧菌(Vibrio. anguillarum)的刺激之后,该C-型凝集素的mRNA水平上呈现明显的上调趋势。重组表达之后的该C-型凝集素蛋白不能凝集细菌,但是在体外细菌结合试验中,对无论革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌都表现出很强的结合活性。重组表达后的蛋白可以促进机体对侵入体内的鳗弧菌的清除,为了研究该凝集素的体内活性,我们利用含有白斑综合症病毒的即刻早期基因(immediate-early gene)中的ie1启动子核心区域的表达载体,将PcLec4的开放阅读框插入该质粒载体中iel启动子之后。该载体经测试表明可以在螯虾体内过表达PcLec4,并且注射了该表达载体的螯虾与对照组相比,当鳗弧菌侵入后表现出更快的清除速度从而帮助机体抵御病原入侵。据我们所知到目前为止这是首次使用该这一质粒来表达一种螯虾的C-型凝集素来研究其功能。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
符号说明  10-11
第一章. 甲壳动物的先天免疫及疾病防治综述  11-21
  引言  11-12
  一、甲壳动物的先天免疫  12-15
    1. 物理防御  12
    2. 细胞免疫  12-13
    3. 体液免疫  13-15
  二、甲壳动物常见病原及防治研究进展  15-18
    1. 白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)  15-16
    2. 鳗弧菌(Vibro anguillarum)  16
    3. 病毒囊膜蛋白可以作为疫苗防治白斑病毒的研究进展  16-18
  三、C-型凝集素(C-Type Lectin)的研究进展  18-20
  四、本论文的研究目的、内容和主要技术路线  20-21
第二章. VP28体内表达载体可提高克氏原螯虾对白斑病毒的抵御能力  21-37
  一、引言  21-22
  二、材料方法  22-25
    2.1 实验动物准备  22
    2.2 白斑病毒的准备  22
    2.3 表达质粒的构建:pIevp28,pIevp19以及pIe  22-23
    2.4 实验动物的免疫注射与病毒刺激  23
    2.5 实时荧光定量PCR  23-24
    2.6 蛋白免疫印记  24
    2.7 免疫组织化学法对WSSV的囊膜蛋白进行定位  24-25
    2.8 死亡率检测  25
    2.9 含有重组质粒的大肠杆菌饲喂实验  25
  三、结果  25-34
    3.1. 重组质粒构建完成  25-26
    3.2. 表达载体pIevp28可以大幅提高螯虾感染白斑病毒之后的存活率  26-27
    3.3. pIevp28质粒可以明显的抑制白斑病毒在螯虾体内的复制  27-28
    3.4. pIevp28中的VP28片段在螯虾体内可以转录并翻译  28-32
    3.5. 免疫组织化学法表明VP28在螯虾体内主要粘附与细胞膜上  32-33
    3.6. 在喂食含有pIevp28载体的大肠杆菌之后,VP 28蛋白可以在螯虾体内表达并起到与注射载体类似的抗病毒功效  33-34
  四、讨论  34-37
第三章. 利用体内过表达载体研究克氏原螯虾C-型凝集素4(PcLec4)的功能  37-50
  一.前言  37-38
  二.材料方法  38-42
    2.1. 涉及的主要生化试剂  38
    2.2. 实验动物的准备与免疫刺激  38-39
    2.3. 总RNA提取并逆转录为cDNA  39
    2.4. RACE法扩增PcLec4的序列全长  39
    2.5. 序列分析  39
    2.6. 实时荧光定量PCR  39-40
    2.7. 重组蛋白的表达和纯化以及多克隆抗体制备  40
    2.8. 蛋白免疫印记  40
    2.9. 重组蛋白的细菌结合实验  40-41
    2.10. 糖结合实验  41
    2.11. 体内过表达实验  41-42
    2.12. 细菌清除实验  42
  三.结果  42-47
    3.1. PcLec4的序列分析结果  42-43
    3.2. PcLec4的进化系统树分析  43-44
    3.3. PcLec4的蛋白表达模式  44-45
    3.4. PcLce4受病原刺激后的表达模式  45-46
    3.5. 重组蛋白对不同细菌的结合能力  46
    3.6. 重组PcLec4蛋白可以对来自病原菌的多糖具有很好的结合能力  46-47
    3.7. 重组PcLec4蛋白的体内过表达及促清除作用  47
  四.讨论  47-50
论文总结  50-51
参考文献  51-59
致谢  59-60
学位论文评阅及答辩情况表  60

含白斑综合症病毒ie1启动子的表达载体的构建与应用研究

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