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牡蛎常见原虫及其快速检测方法研究

作　者: 陈垚
导　师: 陈信忠
学　校: 福建农林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牡蛎寄生原虫 RFTM 培养 ITS 序列多重 PCR 检测法
分类号: S944.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

派琴虫(Perkinsus)、包拉米虫(Bonamia)、马尔太虫（Marteiliarefringens）、闭合孢子虫（Mikrocytos）、尼氏单孢子虫(Haplosporidiumnelsoni)和沿岸单孢子虫（Haplosporidiumcostale)是养殖贝类最主要的寄生虫病病原，在许多国家和地区均有分布，被世界动物卫生组织（OIE）和亚太水产养殖网络中心（NACA）列入重要水生动物疫病名录。本研究对我国东南沿海海区养殖牡蛎中的寄生原虫感染情况进行了调查，对不同地区采集的派琴虫ITS基因序列进行了比对与分析，并建立了同时检测包拉米虫、派琴虫和尼氏单孢子虫的多重 PCR检测方法。为贝类原虫在我国沿海的分布、流行、变异及疾病防控提供了重要的参考资料和技术支持。本研究内容包括四个部分：1、从厦门海区采集菲律宾花蛤和牡蛎样品，建立了派琴虫液体巯基乙酸盐培养法，成功培养到派琴虫休眠孢子，经卢戈氏碘液、吉姆萨染色和无染色三种方式对其形态学进行观察。同时观察到派琴虫以二分裂的方式进行繁殖。2、采用OIE推荐引物建立了六种常见贝类原虫病PCR检测方法和种类鉴定方法，并运用这些方法对我国福建、广东、海南等东南沿海八个地区采集的559份养殖牡蛎样本进行检测和种类鉴定，结果表明：我国东南沿海养殖牡蛎普遍存在包拉米虫、派琴虫、尼氏单孢子虫和沿岸单孢子虫的感染，没有检测到马尔太虫和闭合孢子虫。不同地区这几种原虫的感染率存在较大差异，福建地区派琴虫的感染率均较高，厦门高达47.83%；三亚和海口包拉米虫的感染率均在66.7%以上；广东和海南尼氏单孢子虫和沿岸单孢子虫的感染率均超过了平均感染率28.05%、38.29%。经种类鉴定发现此次检测到的包拉米虫为牡蛎包拉米虫，绝大部分派琴虫为奥尔森派琴虫，仅2株为北海派琴虫。3、建立了能扩增派琴虫ITS全序列的PCR方法，并对从抽样地区检测到的派琴虫ITS序列进行扩增、克隆和测序，进行序列多重比对及同源性分析。结果发现：奥尔森和北海派琴虫ITS序列全长分别为713bp和738bp，5.8S序列高度保守，种内和种间的碱基差异主要表现在ITS-1和ITS-2区域。同源性分析表明：东南沿海八个地区奥尔森派琴虫ITS序列的同源性在100%～99.3%之间，两株北海派琴虫的同源性为97.9%。4、以奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫的保守序列设计特异性引物，包拉米虫采用OIE推荐引物，建立了快速检测这三种原虫的多重PCR检测方法，该方法最低可以检测到10pg的重组质粒模板，且不受其他原虫，细菌和贝类组织的干扰。临床检验结果也表明该方法的检测结果与OIE推荐的PCR检测方法结果一致，而且更加高效、快速。目前关于贝类原虫在我国流行情况的资料还很少，尤其是包拉米虫、尼氏单孢子虫、沿岸单孢子虫、马尔太虫和闭合孢子虫，而本次对我国东南沿海养殖牡蛎感染情况的调查和种类鉴定弥补了这方面的空白；建立了多重PCR同时检测奥尔森派琴虫、包拉米虫和尼氏单孢子虫的方法；通过建立的派琴虫ITS完整基因序列的PCR扩增方法，首次测得了北海派琴虫ITS完整序列；填补了相应领域的空白，是本研究中较为新颖和有特色的地方，为贝类原虫的进一步研究奠定了基础。

全文目录

摘要  10-12
Abstract  12-14
第一章综述  14-27
  1 贝类常见原虫病的概述  14-21
    1.1 派琴虫  14-17
      1.1.1 派琴虫的种类及分布  14
      1.1.2 派琴虫的分类学地位  14-15
      1.1.3 派琴虫的生活史和传播途径  15
      1.1.4 派琴虫的流行病学  15-16
      1.1.5 派琴虫的危害  16
      1.1.6 派琴虫的防治  16-17
    1.2 包拉米虫  17-18
      1.2.1 包拉米虫的种类及分布  17
      1.2.2 包拉米虫的分类学地位及传播方式  17
      1.2.3 包拉米虫的流行病学  17-18
      1.2.4 包拉米虫的危害  18
      1.2.5 包拉米虫的防治  18
    1.3 单孢子虫  18-19
      1.3.1 单孢子虫的分类学地位  18-19
      1.3.2 单孢子虫的流行病学  19
      1.3.3 单孢子虫的危害及防治  19
    1.4 马尔太虫  19-20
      1.4.1 马尔太虫的种类及分类地位  19-20
      1.4.2 马尔太虫的形态及生活史  20
      1.4.3 马尔太虫的流行病学及危害  20
    1.5 马氏闭合孢子虫  20-21
  2 常见贝类原虫检测方法的研究进展  21-25
    2.1 形态学检测方法  21-22
      2.1.1 组织印记法  21
      2.1.2 组织病理切片技术  21
      2.1.3 电镜技术  21-22
    2.2 免疫学检测方法  22
    2.3 分子生物学检测方法  22-24
      2.3.1 PCR 检测方法  22-23
      2.3.2 原位杂交检测技术  23
      2.3.3 实时荧光定量 PCR 技术  23-24
    2.4 派琴虫体外培养方法的研究  24-25
      2.4.1 液体巯基乙酸盐培养法（RFTM）  24
      2.4.2 派琴虫其它体外培养方法  24-25
  3 派琴虫种类变异研究进展  25-27
第二章牡蛎派琴虫的培养和形态学观察  27-34
  1 材料与方法  27-29
    1.1 材料  27-28
      1.1.1 材料来源  27
      1.1.2 主要试剂  27
      1.1.3 主要设备与耗材  27
      1.1.4 试剂的配制  27-28
    1.2 试验方法  28-29
      1.2.1 牡蛎样品石蜡切片的制备  28
      1.2.2 派琴虫休眠孢子的培养  28-29
      1.2.3 派琴虫休眠孢子染色镜检  29
      1.2.4 派琴虫休眠孢子分裂方式的观察  29
  2 结果与分析  29-32
    2.1 派琴虫滋养体的观察  29
    2.2 派琴虫休眠孢子的培养结果  29-32
    2.3 派琴虫休眠孢子分裂方式的观察结果  32
  3 讨论  32-34
第三章 PCR 检测贝类常见原虫方法的建立与我国东南沿海贝类常见原虫的调查  34-46
  1 材料与方法  34-38
    1.1 材料  34-35
      1.1.1 材料来源  34
      1.1.2 主要试剂  34-35
      1.1.3 试剂配制  35
      1.1.4 主要设备  35
    1.2 试验方法  35-38
      1.2.1 样品总 DNA 提取  35
      1.2.2 六种贝类常见原虫病 PCR 检测方法的建立  35-37
      1.2.3 派琴虫和包拉米虫种类鉴定方法的建立  37-38
    1.3 我国东南沿海几种常见贝类原虫的抽样调查与种类鉴定  38
  2 结果  38-44
    2.1 六种贝类原虫 PCR 检测结果  38-39
    2.2 PCR 扩增阳性产物测序结果  39-41
    2.3 我国东南沿海六种常见贝类原虫的抽样调查结果  41-42
    2.4 派琴虫和包拉米虫种类鉴定结果  42-44
      2.4.1 派琴虫种类鉴定结果  42-43
      2.4.2 包拉米虫种类鉴定结果  43-44
  3 讨论  44-46
第四章奥尔森派琴虫和北海派琴虫 ITS 基因序列分析及同源性分析  46-56
  1 材料与方法  46-48
    1.1 材料  46-47
      1.1.1 材料来源  46
      1.1.2 主要试剂与耗材  46
      1.1.3 试剂配制  46-47
      1.1.4 主要设备  47
    1.2 试验方法  47-48
      1.2.1 样品总 DNA 提取  47
      1.2.2 ITS 序列 PCR 扩增引物的设计与合成  47
      1.2.3 PCR 扩增体系及反应条件的优化  47
      1.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析  47-48
      1.2.5 目的片段的回收、克隆和质粒提取  48
      1.2.6 奥尔森派琴虫和北海派琴虫 ITS 序列及同源性分析  48
  2 结果  48-50
    2.1 ITS 序列 PCR 反应条件优化及扩增结果  48-49
    2.2 重组质粒测序结果  49
    2.3 奥尔森派琴虫 ITS 序列分析与同源性分析  49
    2.4 北海派琴虫 ITS 序列分析与同源性分析  49-50
  3 讨论  50-56
第五章多重 PCR 同时检测包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫方法的建立和应用  56-63
  1 材料和方法  56-58
    1.1 实验材料  56
      1.1.1 实验材料来源  56
      1.1.2 试剂  56
      1.1.3 实验设备  56
    1.2 方法  56-58
      1.2.1 样品总 DNA 的提取  56
      1.2.2 多重 PCR 引物的设计与合成  56-57
      1.2.3 PCR 扩增体系及反应条件的优化  57-58
      1.2.4 PCR 扩增产物电泳分析及克隆测序  58
      1.2.5 特异性试验  58
      1.2.6 敏感性试验  58
      1.2.7 临床样本的检测  58
  2 结果  58-62
    2.1 多重 PCR 反应条件优化结果  58-59
    2.2 特异性试验结果  59-60
    2.3 敏感性实验结果  60
    2.4 测序结果与序列比对  60-61
    2.5 临床样品的检测结果  61-62
  3 讨论  62-63
全文总结  63-64
参考文献  64-71
附录  71-75
致谢  75

牡蛎常见原虫及其快速检测方法研究

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