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乌鳢感染A.veronii差异基因的筛选及代表性基因在体内表达规律研究

作　者: 单晓枫
导　师: 钱爱东
学　校: 吉林农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 乌鳢维氏气单胞菌抑制性消减杂交cDNA文库 RACE 实时荧光定量PCR
分类号: S943
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

乌鳢作为食补与药补于一身的名贵鱼类,在我国深受广大消费者的喜爱。近年来,随着乌鳢养殖面积的增加、集约化养殖的发展,其病害也逐年增多,尤其是细菌性疾病日趋严重,已成为制约乌鳢养殖业健康可持续发展的重大障碍。目前,有关乌鳢细菌性疾病的治疗多采用投喂抗生素的方法,但此方法易导致乌鳢体内药物残留以及细菌耐药性增加。研发新型无毒渔药与利用免疫相关基因进行抗病品系选育是乌鳢养殖业健康可持续发展的趋势,因此,必须对乌鳢抗病免疫相关基因及免疫机理进行深入研究。本研究应用SSH技术,成功构建维氏气单胞菌感染后的乌鳢头肾SSH cDNA文库,并经筛选、测序,获得有效序列202条,其中,73个序列未搜到同源性,其余129条序列按可能功能共分为6大类,免疫相关基因序列25条,占总数的13%。在乌鳢头肾SSH cDNA文库的基础上,从中选出疑似Cu/Zn-SOD、Rac2、MPO的基因片段,并利用RACE技术获得了三种免疫相关基因的全长cDNA序列,采用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构及氨基酸同源性进行了分析；用实时荧光定量PCR技术分析了免疫相关基因在健康乌鳢的不同组织中表达分布以及感染维氏气单胞菌后的表达变化。结果显示：Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列810bp,其ORF465bp、编码154个氨基酸；多重序列比较分析,Cu/Zn-SOD氨基酸序列与莫桑比克罗非鱼同源性为95%；实时荧光定量PCR分析表达显示：Cu/Zn-SOD基因在健康乌鳢的头肾、肾、鳃、心、脾、肝、肌肉、肠等八个组织中均有表达,肝脏中的表达量最高；感染维氏气单胞菌后,其在不同组织中的表达量变化大致呈现：先上升后下降并维持一段时间,后又有上升的趋势。Rac2基因全长cDNA序列1179bp,其ORF579bp、编码192个氨基酸；通过氨基酸序列比较分析,各物种Rac2高度同源；实时荧光定量PCR分析表达显示：Rac2基因在健康乌鳢的头肾、肾、鳃、心、脾、肝、肌肉等七个组织中均有表达,不在肠中表达,其中,头肾表达量最高；感染维氏气单胞菌后,Rac2在乌鳢7个组织中的表达量,随感染时间不同而发生变化,但均在感染后的36h时,表达量上调,基本超过0h时的表达量。MPO基因全长cDNA序列3181bp,其ORF2301bp、编码766个氨基酸；通过氨基酸序列比较分析,各物种MPO蛋白存在歧化；实时荧光定量PCR分析表达显示：MPO基因在健康乌鳢的头肾、肾、鳃、心、脾、肝、肌肉等七个组织中均有表达,在肠中不表达,其中,头肾表达量最高；感染维氏气单胞菌后,MPO在大多数组织中低水平表达；所有组织中一般在感染后的36h时,表达量有上升的趋势。本研究成功的构建了乌鳢头肾SSH cDNA文库,并获得了大量与乌鳢抗菌感染相关的基因片段,在此基础上,应用RACE技术获得三种免疫相关基因的全长,利用生物信息学对其进行了较为系统的分析,同时探讨了这三种基因的表达模式。研究成果为进一步了解并研究乌鳢抗菌感染的分子免疫机制奠定基础,同时为抗病品种的选育及病害防治提供了基础理论数据。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
前言  11-12
第一篇文献综述  12-31
  1.1 乌鳢及其主要病害  12-14
  1.2 鱼类抗菌相关的免疫因子  14-22
  1.3 差异基因筛选技术  22-28
  1.4 cDNA末端快速扩增技术(rapid amplication of cDNA ends,RACE)  28-30
  1.5 本研究的目的与意义  30-31
第二篇研究内容  31-114
  第一章乌鳢头肾消减cDNA文库的构建及差异基因的筛选  31-49
    1.1 材料  31-32
    1.2 方法  32-39
    1.3 结果  39-47
    1.4 讨论  47-48
    1.5 小结  48-49
  第二章乌鳢Cu/Zn-SOD基因的克隆与表达分析  49-68
    2.1 材料  49-50
    2.2 方法  50-53
    2.3 试验结果  53-65
    2.4 讨论  65-66
    2.5 小结  66-68
  第三章乌鳢Rac2基因的克隆与表达分析  68-85
    3.1 材料  68
    3.2 方法  68-70
    3.3 试验结果  70-83
    3.4 讨论  83-84
    3.5 小结  84-85
  第四章乌鳢MPO基因的克隆与表达分析  85-114
    4.1 材料  85
    4.2 方法  85-87
    4.3 试验结果  87-112
    4.4 讨论  112-113
    4.5 小结  113-114
结论  114-115
参考文献  115-127
作者简介  127-128
致谢  128-129

乌鳢感染A.veronii差异基因的筛选及代表性基因在体内表达规律研究

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