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团头鲂池塘维氏气单胞菌的致病性、耐药性、基因分型及其分布研究

作　者: 周光
导　师: 徐跑
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水产养殖学
关键词: 团头鲂败血症维氏气单胞菌生态分布毒力基因 ERIC-PCR
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

团头鲂细菌性败血症是池塘中危害非常严重的一种细菌性鱼病。本文对常州武进某暴发细菌性出血病团头鲂养殖池塘开展了病原菌的分离鉴定，在池塘中的生态分布，以及不同生态位分离维氏气单胞菌菌株的毒力基因分布、药敏试验及其ERIC-PCR基因分型研究。试验结果以期为团头鲂出血病的科学用药、致病菌的流行分布规律以及致病机理提供一定的基础研究。本研究主要分为以下几个部分。1团头鲂细菌性败血症病原菌的分离鉴定及其在池塘中的分布2010年7月底8月初常州武进某塘口发生团头鲂出血病。对该池塘进行了7天的跟踪采样，每天从患病鱼体、水体、底泥、浮游生物等不同生态位点用气单胞菌选择性培养基进行菌株的初步分离，用氧化酶、接触酶、O\F阳性，气单胞菌特异性引物确定属，再用鸟氨酸脱羧酶、gyrB管家基因鉴定至种。同时统计不同生态位维氏气单胞菌的数量及比例。结果显示：分离得到的维氏气单胞菌的gyrB基因序列与已知菌株的相似率大都在98%以上，gyrB基因在气单胞菌属内种水平的鉴定上具有很高的分辨率；从不同生态位分离鉴定到168株气单胞菌，其中有56株维氏气单胞菌，分别分布于肠道、鳃、体表粘液、底泥、浮游生物、腹腔、肝脏、肾脏等生态位点，表明维氏气单胞菌广泛分布于池塘；维氏气单胞菌占分离到的气单胞菌33.4%，说明维氏气单胞菌为池塘中主要的气单胞菌之一；维氏气单胞菌占气单胞菌在鳃等鱼体上的比例明显高于水体和浮游生物；随着病情的好转，维氏气单胞菌的数量有所下降，但是在池塘中总能分离到。2维氏气单胞菌毒力基因的检测、药敏试验及在不同生态位间的比较本试验首先通过人工感染测定了56株维氏气单胞菌的致病性。然后检测了分离菌株对恩诺沙星等11种药物的敏感性，分析比较不同生态位维氏气单胞菌的药敏性差异。PCR扩增两个毒力基因：气溶素基因和细胞兴奋性肠毒素基因，测定了两个毒力基因的分布情况，分析比较不同生态位分离菌株毒力基因检测率的差异，并初步探讨了菌株的致死率与两种毒力基因之间的相关性。结果显示：维氏气单胞菌具有一定的致病性，以注射细菌浓度109cuf/mL、0.5mL／100g鱼体为准，56株维氏气单胞菌中48h死亡率在40%以上的菌株有26株，证明了维氏气单胞菌能够引起团头鲂的细菌性出血病,为引起团头鲂细菌性出血病的致病菌之一。不同生态位菌株的致死率没有明显差异；维氏气单胞菌对大多数抗生素耐药，对氨苄西林完全耐药，对复方新诺明、诺氟沙星、洛美沙星的耐药率也分别高达94.6%、94.6%、91.1%，仅对多粘菌素、庆大霉素较为敏感，敏感率分别为64.3%、48.2%。此外，鱼体上分离到的菌株的耐药率(67.2%)要明显大于外环境中菌株对药物的耐药率(40%)，说明感染鱼体菌株耐药性强；细胞兴奋性肠毒素alt、溶血素hly的检出率分别为26.8%、48.2%，具有两种毒力基因的菌株19.6%。此外，鱼体上分离到的菌株的毒力基因检测率alt(30.4%)、hly(47.8%)要明显大于外界环境菌株的alt(10%)、hly(40%)检测率；(alt+、hly+)、(alt+、hly-)、(alt-、hly+)、(alt-、hly-)四种毒力基因菌株型48h致死率分别为41.8%、35%、32.3%、29.2%，表明死亡率与这两种毒力基因可能存在一定的正相关性。3维氏气单胞菌的ERIC-PCR基因分型及在不同生态位间的比较本试验应用了ERIC-PCR细菌基因分型的方法对确定的56株不同生态位维氏气单胞菌ERIC片段进行扩增，用BIO-PROFIL软件进行聚类分析，采用平均连锁法(UPGMA)绘制聚类树状图，获得遗传相似图。比较了各种基因型菌株在池塘中不同生态位间的分布情况。结果显示，以80%相似度为界，56株维氏气单胞菌分为13个基因型，其中Ⅱ型最多，19株。其次为Ⅵ、Ⅷ、Ⅴ型，分别为7、6、5株。Ⅳ、Ⅶ、Ⅻ、ⅩⅢ最少，全部只有1株；不同生态位大多有交叉的基因型出现，但是菌株最多的Ⅱ型，只在鱼体(鳃、体表粘液、肠道内容物)出现，而在外环境中(水、浮游生物、底泥等)没有出现，且Ⅱ型菌株的总体致病性要强于平均水平，说明对于某一种基因型，可能具有较高的致病性；另外Ⅳ、Ⅸ型是肠道所特有的基因型，说明对于有些基因型的维氏气单胞菌可能对生存的生态环境具有选择性。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
引言  12-14
第一章文献综述  14-24
  1.1 团头鲂细菌性疾病  14-15
    1.1.1 团头鲂生物学特性  14
    1.1.2 团头鲂细菌性出血病  14
    1.1.3 团头鲂细菌性出血病的防治  14-15
  1.2 维氏气单胞菌研究进展  15-19
    1.2.1 维氏气单胞菌的分类地位  15-16
    1.2.2 维氏气单胞菌的生化特性  16
    1.2.3 维氏气单胞菌的致病性、耐药性及其分布  16-18
    1.2.4 维氏气单胞菌毒力基因  18-19
  1.3 管家基因序列鉴定和分析  19-21
    1.3.1 gyrB 基因简介  19-20
    1.3.2 gyrB 基因在细菌鉴定及系统发育树分析中的应用  20-21
  1.4 ERIC-PCR 基因分型及其应用  21-22
    1.4.1 细菌基因分型简介  21
    1.4.2 ERIC-PCR 基因分型的应用  21-22
  1.5 本试验研究的目的及意义  22-24
第二章维氏气单胞菌的分离鉴定及其池塘生态分布  24-38
  2.1 材料  24-26
    2.1.1 菌株来源  24
    2.1.2 主要试剂和培养基  24-25
    2.1.3 主要仪器和设备  25-26
  2.2 方法  26-30
    2.2.1 菌株的分离、初步筛选及保存  26
    2.2.2 细菌模板 DNA 提取  26-27
    2.2.3 气单胞菌属的阳性克隆的确认  27-28
    2.2.4 维氏气单胞菌的筛选  28-29
    2.2.5 细菌生化特性试验及形态观察  29
    2.2.6 数据处理  29-30
  2.3 结果与分析  30-34
    2.3.0 菌株的初步筛选  30
    2.3.1 不同生态位及不同时间气单胞菌检出率的分布情况  30-31
    2.3.2 维氏气单胞菌的分子鉴定  31-32
    2.3.3 维氏气单胞菌不同生态位的分布情况  32-33
    2.3.4 维氏气单胞菌的生化特性及形态特征  33-34
  2.4 讨论  34-38
第三章维氏气单胞菌的致病性、药敏实验研究及在不同生态位间的比较  38-48
  3.1 材料  38
    3.1.1 菌株来源  38
    3.1.2 试剂  38
    3.1.3 仪器和设备  38
  3.2 方法  38-41
    3.2.1 人工感染  38-39
    3.2.2 维氏气单胞菌对 11 种药物的敏感试验  39
    3.2.3 维氏气单胞菌溶血素基因的检测  39-40
    3.2.4 维氏气单胞菌细胞兴奋性肠毒素基因的检测  40
    3.2.5 数据处理  40-41
  3.3 结果与分析  41-45
    3.3.1 人工感染  41-42
    3.3.2 维氏气单胞菌药敏性  42-43
    3.3.3 气溶素、细胞兴奋性肠毒素基因的检测  43-45
  3.4 讨论  45-48
第四章维氏气单胞菌的基因分型及在不同生态位间的比较  48-54
  4.1 材料  48
    4.1.1 菌株来源  48
    4.1.2 试剂  48
    4.1.3 仪器与设备  48
  4.2 方法  48-49
    4.2.1 引物  48
    4.2.2 目的片段的扩增  48-49
    4.2.3 数据处理  49
  4.3 结果与分析  49-53
    4.3.1 维氏气单胞菌 ERIC-PCR 产物扩增片段  49-50
    4.3.2 维氏气单胞菌指纹图谱聚类分析图(UPGMA)  50-51
    4.3.3 不同生态位基因型的分布情况  51-52
    4.3.4 不同基因型维氏气单胞菌致死率的比较  52-53
  4.4 讨论  53-54
全文总结  54-56
参考文献  56-66
附录：论文发表及学术交流  66-68
致谢  68

团头鲂池塘维氏气单胞菌的致病性、耐药性、基因分型及其分布研究

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