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鲤鱼肿瘤坏死因子-α1基因克隆、鉴定及差异表达分析

作　者: 赵晓
导　师: 卢强
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鲤鱼 TNFα1 cDNA克隆基因组DNA克隆序列分析转录分析
分类号: S941.99
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

随着分子生物学技术和基因克隆技术的发展，人们对非哺乳类脊椎动物的免疫系统的研究越来越深入、系统，尤其是对在鱼类扩大养殖以及抗病中具有一定的应用价值的细胞因子的研究。细胞因子(cytokines)是在研究高等动物的免疫系统时发现的，它在免疫系统的调节反应中起着至关重要的作用。研究发现，细胞因子在调节和控制免疫反应中，其分子在进化过程中具有高度的保守性[1]。在哺乳类中，炎症会导致细胞因子的级联反应，而TNFα通常是最先被释放的细胞因子，其后即为IL-1β，所以说，TNFα在炎症反应早期起关键作用。TNFα是由几种免疫细胞分泌产生的：单核细胞或巨噬细胞、NK细胞、神经细胞和激活的B细胞[2-3]，TNFα负责一系列细胞间的信号传导功能。除了作为抵抗寄生虫、细菌和病毒感染的重要介质外，TNFα在机体内还具有治疗的作用，包括抗肿瘤、休克和胚胎发育等，但是同时分泌量过多会产生致命的病理效应[4-6]。TNFα基因在鱼类天然免疫中起着重要的作用，它是一种促炎介质，当分泌过量时会导致颤抖和组织损伤，分泌量过低会引起胰岛素抗性状态[1]。本研究以EST测序获得的含有鲤鱼 TNFα1部分cDNA序列的克隆作为核酸探针，经地高辛标记后，应用核酸杂交法筛选有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库，获得鲤鱼TNFα1cDNA的全长序列；根据获得的TNFα1cDNA的全长序列在其两侧的非翻译区设计引物，以鲤鱼脾脏全基因组为模板，用PCR方法获得了TNFα1的全长基因组DNA序列；而后，根据获得的TNFα1的cDNA全长序列和基因组DNA全长序列设计引物，采用实时荧光定量PCR的方法，对分离培养的正常白细胞和经丝列原刺激的白细胞中该基因不同时间的转录差异情况进行了分析。结果显示：获得的鲤鱼TNFα1cDNA克隆全长为1319bp，含有一个推测编码255个氨基酸的长768bp的开放阅读框，以及5非翻译区和3非翻译区和典型的3poly(A)加尾信号（AATAAA）。获得的基因组DNA全长2748bp，序列分析及系统进化分析表明该基因进化保守，与大部分物种一样均含4个外显子和3个内含子，各外显子的碱基数与哺乳动物中相对应的外显子的碱基数基本相似，并且内含子外显子的剪接位点均遵循GT-AG规则；荧光定量PCR分析显示：经丝裂原刺激后，白细胞中TNFα1基因的转录增强，尤其是经LPS、PHA联合刺激后转录水平增强极为显著，但是随着时间的延长增强幅度趋于下降。该结果提示TNFα1的转录水平对不同刺激物的敏感程度不同，也说明该细胞因子在细胞受刺激早期发挥免疫作用。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
英文缩写词表  10-11
前言  11-13
第一篇文献综述  13-25
  第1章肿瘤坏死因子-α研究进展  13-25
    1 肿瘤坏死因子的来源  13-14
    2 TNF 在动物体内的结构和进化史  14-16
    3 TNFs 的表达以及其调节  16-18
    4 TNFα 的生物学活性  18-23
    5 结语  23-25
第二篇研究内容  25-61
  第1章鲤鱼肿瘤坏死因子α1 全 cDNA 克隆及序列分析  25-39
    1 材料与方法  25-31
    2 结果  31-36
    3 讨论  36-38
    4 小结  38-39
  第2章鲤鱼肿瘤坏死因子α1 基因组 DNA 克隆及序列分析  39-47
    1 材料与方法  39-41
    2 结果  41-44
    3 讨论  44-45
    4 小结  45-47
  第3章鲤鱼肿瘤坏死因子-α1 基因的差异表达分析  47-61
    1 材料与方法  47-51
    2 结果  51-58
    3 讨论  58-60
    4 小结  60-61
结论  61-62
参考文献  62-70
导师简介  70-71
作者简介  71-72
致谢  72

鲤鱼肿瘤坏死因子-α1基因克隆、鉴定及差异表达分析

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