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近江牡蛎一种四跨膜素鉴定及功能研究

作　者: 罗鸣
导　师: 吴信忠
学　校: 浙江大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 四跨膜素牡蛎变异定位血蓝蛋白类凝集素宿主免疫
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

软体动物的免疫系统包括体液应答和各种免疫细胞的细胞反应,这些反应包括活性氧的产生,抗微生物肽的分泌,包囊作用以及吞噬作用,例如,血淋巴细胞形成了宿主的主要防御系统,血淋巴细胞的粘附和运动在吞噬外来异物和向炎症部位转移过程中发挥了重要作用。由于血淋巴细胞的粘附行为,造成诸如对寄生虫的包囊作用和血淋巴细胞介导的凝血反应等,这些反应可能是由于位于细胞表面的特异的受体分子诱导的,且这些受体接收和传递不同的生物反应信号。因此,鉴定影响软体动物免疫系统的因子如血淋巴细胞的表面受体分子将有助于我们搞清楚作为病原载体的软体动物的免疫系统,同时为理解寄生虫的传播开辟一条新途径。本研究利用SMARTM技术构建了近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)LPS刺激下血淋巴细胞的全长cDNA文库。经筛选和PCR鉴定后我们挑选了120个阳性克隆进行了测序分析,共获得了100个EST序列,其中包含了7个未报道的近江牡蛎血淋巴细胞的全长序列(四跨膜素tetraspanin, FJ475123;癌基因FosB, FJ594438;铁蛋白ferritin, FJ529405;烟酰胺腺嘌呤脱氢酶NADH, FJ495091;QM样蛋白QM-like, FJ467930;腺苷高半胱氨酸水解酶SAHH, FJ495090;泛素因子u-box, FJ495092)。通过NCBI匕对和生物信息学软件分析,这些基因分别与物质代谢、转录调控、呼吸代谢、蛋白降解以及天然免疫等作用相关。四跨膜素(又称为四跨膜蛋白)是一种具有四段跨膜结构的大基因家族,该家族成员在哺乳动物、昆虫、蠕虫和真菌中都有发现。四跨膜素蛋白可以调控细胞的形状、运动、入侵、融合以及膜表面复合体的信号传导。第一种四跨膜素蛋白(ME491/CD63)在1988年进行了报道,而标志性的序列特征报道则出现在1990年。除了四段跨膜结构以外,四跨膜素还具有几个保守的氨基酸残基包括高度保守的CCG,而月.还有两个半胱氨酸残基,这对于形成四跨膜素的胞外环结构至关重要。在哺乳动物的免疫细胞(如T和B淋巴细胞,粒细胞,单核细胞,巨噬细胞,树突细胞和自然杀伤细胞)至少具有八种四跨膜素。这些四跨膜素直接间接通过大量的免疫分子发生作用,例如T细胞受体,B细胞受体,主要组织相容性复合体1类分子等等。我们在牡蛎血淋巴细胞cDNA文库中鉴定了一种四跨膜素分子命名为Ca-TSP,并且发现在血淋巴细胞的转录表达中具有变异,发现三种不同的Ca-TSP分子。利用免疫荧光和免疫电镜检测我们发现Ca-TSP位于牡蛎血淋巴细胞的颗粒及囊泡状结构中。序列分析、结构预测以及免疫电镜检测显示Ca-TSP是一种位于颗粒上的整合的糖蛋白,可能是一种和CD63类似的蛋白。通过对分离的牡蛎的血淋巴细胞的基因表达分析,在LPS和PolyⅠ:C刺激的前12小时中Ca-TSP的表达显示上调,而H2O2刺激下Ca-TSP的表达显示降低。Western blot得出了类似的结果。实验同时发现：重组表达的Ca-TSP可以显著抑制血淋巴细胞的聚集,结果显示Ca-TSP可能参与牡蛎血淋巴细胞的天然免疫过程。为了寻求牡蛎四跨膜素的功能性解释,我们进行了蛋白质相互作用和信号传导途径方面的检测。免疫荧光实验结果显示Ca-TSP与血蓝蛋白共同位于牡蛎的血淋巴细胞中,蛋白质相互作用检测发现Ca-TSP和血蓝蛋白以及一种类凝集素蛋白形成复合体。未知蛋白检测出血细胞凝集特性,但它仍然可能是一种复合物,因此牡蛎的Ca-TSP的免疫应答可能有血蓝蛋白和这种类凝集素的参与。我们利用MEK的抑制剂来检测可能涉及的信号传导通路,当血细胞同U0126和PD98059两种抑制剂混合后检测,发现MAPK的磷酸化水平在1小时后是下降的,在12小时后升高了一点,而Ca-TSP的表达量是下调的,因此我们推测Ca-TSP可能是受MAPK诱导的,并且其中可能有其它的信号途径参与。

全文目录

致谢  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-14
本文所用缩略语  14-16
引言  16-17
研究内容与技术路线  17-19
  研究内容  17-18
  技术路线  18-19
第一章四跨膜素研究进展  19-27
  四跨膜素的分子相互作用  20-21
  四跨膜素与整合素  21-22
  四跨膜素的免疫功能  22-24
  非脊椎动物的四跨膜素  24-25
  四跨膜素的棕榈酸化作用  25
  四跨膜素与脂筏(LIPID RAFTS)  25-26
  展望  26-27
第二章软体动物血蓝蛋白研究进展  27-33
  血蓝蛋白的结构  28
  血蓝蛋白的进化  28-29
  血蓝蛋白的功能  29-31
  展望  31-33
第三章近江牡蛎在脂多糖(LPS)刺激下血淋巴细胞全长CDNA文库构建  33-48
  1 材料和方法  33-41
    1.1 材料  33-35
    1.2 方法  35-41
  2 结果  41-45
  3 讨论  45-48
第四章近江牡蛎CA-TSP基因CDNA序列的克隆与特性分析  48-64
  1 材料和方法  48-54
    1.1 材料  48-49
    1.2 方法  49-54
  2 结果  54-61
  3 讨论  61-64
第五章近江牡蛎CA-TSP基因的原核表达与鉴定  64-75
  1 材料和方法  64-70
    1.1 材料  64-66
    1.2 方法  66-70
  2 结果  70-74
  3 讨论  74-75
第六章近江牡蛎CA-TSP基因的亚细胞和超微结构定位以及免疫应激下的表达分析  75-86
  1 材料与方法  75-79
  2 结果  79-84
  3 讨论  84-86
第七章重组表达CA-TSP蛋白对牡蛎血淋巴细胞体外聚集抑制的研究  86-90
  1. 材料和方法  86-87
  2 结果  87-89
  3 讨论  89-90
第八章近江牡蛎CA-TSP蛋白和血蓝蛋白以及类凝集素蛋白相互作用的研究  90-102
  1 材料与方法  90-95
  2 结果  95-99
  3 讨论  99-102
全文小结  102-104
  1 本研究的主要成果和结论  102
  2 本研究的主要创新点  102-103
  3 进一步研究方向  103-104
参考文献  104-114
科研成果  114

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