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小麦籽粒硬度相关基因分子鉴定及PINA蛋白缺失分子机制研究

作　者: 张福彦
导　师: 崔党群；陈锋
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 普通小麦 籽粒硬度 Puroindoline Puroindoline b-2 等位变异 产量性状
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


籽粒硬度是重要的小麦品质性状之一,严重影响润麦加水量、出粉率、破损淀粉粒数量和面粉颗粒度大小,并最终决定磨粉品质和食品加工品质,是国内外小麦市场分级和定价的重要依据之一。本试验以河南农业大学小麦育种研究室提供的278份黄淮麦区的地方品种、当前主栽品种和小麦区域试验新品系为材料,利用单籽粒谷物特性测定仪(SKCS)、特异性引物的PCR扩增、限制性内切酶技术、DNA克隆和测序技术以及实时荧光定量PCR的方法,对所有试验材料的产量相关性状、籽粒硬度表型、Puroindo1ine基因型及其Puroindo1ine b-2的不同等位变异类型进行了鉴定与分析。同时,以来自我国和CIMMYT的12份普通小麦品种为材料,采用引物步移的方法研究PINA蛋白缺失的分子机理以及开发相应的功能性标记。本文主要结论如下:1.黄淮麦区小麦品种以硬质类型为主,其硬度变异范围较广。参试品种中,硬质麦比例高达57.4%,而混合型和软质麦比例则分别仅为8.9%和33.7%,SKCS硬度指数范围为-2～78.6。硬质麦的Puroindo1ine基因型检测中,共检测到Pinb-D1b、Pinb-D1p、Pina-D1b和Pina-D1l四种已知类型,其中Pinb-D1b所占比例最高,占79.4%,其次是Pinb-D1p,为12.4%,而Pina-D1b和Pina-D1l则分别仅为4.1%和1.0%。参试的109份黄淮麦区小麦新品系中,硬质麦所占比例更高,达到61.5%,而混合型和软质麦比例分别仅为15.6%和22.9%,硬质麦的Puroindo1ine基因型检测中,只检测到Pinb-D1b、Pinb-D1p和Pina-D1b三种类型,其中Pinb-D1b所占比例最高,占86.5%,而Pinb-D1p和Pina-D1b则分别仅为7.5%和6.0%。因此,建议黄淮海地区的小麦育种中应适当扩大基因资源的利用范围,如在优质品种的培育过程中进一步采用Pinb-D1d、Pinb-D1e和Pinb-D1g等相对优异的基因类型作亲本,从而能够加快优质小麦品种的培育进程。2.采用引物步移技术对PINA蛋白缺失中的主体类型Pina-D1b类型进行了分子机制研究,发现该类型与野生型的Ha位点相比,从第23个碱基(相对于Pina基因的ATG)开始有一个15, 380 bp的大片段缺失,并在缺失片段两侧设计引物后进行扩增,成功开发出了能够直接在分子水平上进行检测Pina-D1b类型的功能性分子标记Pina-N1。该标记可代替先前检测Pina-D1b类型应用较为广泛的SDS-PAGE技术,在DNA水平上直接检测出PINA蛋白缺失类型,从而能够极大地提高检测效率和降低检测成本。3.在地方品种江东门(江苏)、和尚头(河南)、红蜷芒(河南)中发现了一种新的PINA蛋白缺失类型,将其命名为Pina-D1r。采用引物步移技术对其分子机制研究发现,与野生型相比,Pina-D1r类型的Ha位点有一个10, 415 bp的大片段缺失,其缺失位点从-5117 bp到+5298 bp(相对于Pina基因的ATG)。依据其分子特征开发了能够跨越缺失体的功能性标记Pina-N2,该标记能够直接在分子水平上进行检测Pina-D1r类型。4.进一步对Puroindo1ine b-2基因的变异类型检测表明,所有供试的246份材料(不包括混合型)在Puroindo1ine b-2位点上都含有Pinb-D2v1和Pinb-A2v4两种基因,所有调查品种中,有58个品种是Pinb-B2v2变异类型,占所调查总数的23.6%;而剩余的188个品种中都是含有Pinb-B2v3类型,占所调查总数的76.4%。因此,在黄淮麦区小麦中,Pinb-A2v4/Pinb-B2v3/Pinb-D2v1组合是Puroindoline b-2基因中是最为常见的类型。在软质小麦品种(Pina-D1a/Pinb-D1a)中,含有Pinb-B2v3变异品种的SKCS平均硬度指数(27.2)显著高于Pinb-B2v2变异(22.2),而硬质小麦中分别含有Pinb-D1b或Pinb-D1p基因类型的亚组中,Pinb-B2v2和Pinb-B2v3变异的分组对籽粒硬度没有显著差异,因此,就籽粒硬度而言,Puroindoline b-B2位点变异对软质小麦的影响比硬质小麦更大。进一步对位于普通小麦B组Puroindo1ine b-B2的两个基因型进行产量相关性状分析后发现,拥有Pinb-B2v3变异的小麦品种在穗粒数、单穗粒重、旗叶长和旗叶面积上都显著高于拥有Pinb-B2v2变异类型的小麦品种,同时Pinb-B2v3变异类型的千粒重、小穗数、粒长、粒宽和旗叶宽等性状也略高于Pinb-B2v2变异类型,表明Pinb-B2v3变异类型的相关产量农艺性状略优于Pinb-B2v2类型。5.对Puroindo1ine b-B2位点的不同等位变异进行荧光定量,结果表明,Pinb-2v3变异类型的小麦中mRNA相对表达量显著高于Pinb-2v2变异类型的小麦的表达量,三种不同类型的Pinb-2v3等位变异类型中,Pinb-2v3b的相对表达量最高,而本实验先前表明,拥有Pinb-2v3类型的小麦品种产量相关性状明显优于拥有Pinb-2v2类型的品种,从而推测认为,Puroindo1ine b-B2基因的表达量可能与小麦产量相关性状的优越性呈正相关关系。进一步对不同组织中的Pinb-B2v基因表达量进行研究表明,Puroindo1ine b-B2基因在叶片中的表达量显著高于其在根中的表达量。

全文目录


致谢  4-7摘要  7-91 文献综述  9-25  1.1 小麦籽粒硬度形成及其测定方法  9-12    1.1.1 籽粒硬度的形成  9-10    1.1.2 籽粒硬度测定方法  10-12  1.2 籽粒硬度的影响因素  12-13  1.3 小麦籽粒硬度的分子遗传基础  13-17    1.3.1 普通小麦中籽粒硬度遗传基础  13    1.3.2 普通小麦中Pin a 基因特征  13-14    1.3.3 普通小麦中Pin b 基因特征  14-16    1.3.4 普通小麦中Puroindoline 变异类型  16-17  1.4 普通小麦中Puroindoline 基因的分布  17-20    1.4.1 Puroindoline 基因在国外的分布  17-18    1.4.2 Puroindoline 基因在我国主要麦区中的分布  18-20  1.5 籽粒硬度对其它小麦品质形状的影响  20-21  1.6 其它类Puroindoline 基因的多态性  21-25    1.6.1 Gsp-1 基因  21-23      1.6.1.1 Gsp-1 基因的发现  21-22      1.6.1.2 Gsp-1 基因特征及其功能  22-23    1.6.2 Puroindoline b-2v 基因  23-25      1.6.2.1 Puroindoline b-2v 基因的发现  23      1.6.2.2 Puroindoline b-2v 基因特征及其功能  23-25  1.7 研究目的及意义  252 引言  25-273 材料与方法  27-32  3.1 试验材料  27  3.2 试验方法  27-32    3.2.1 测量农艺性状和籽粒硬度的指数  27-28    3.2.2 DNA 的提取  28    3.2.3 籽粒硬度蛋白提取及SDS-PAGE 电泳  28-29    3.2.4 步移引物的设计及PCR 扩增  29    3.2.5 Puroindoline -D1 和Puroindoline b-2v 变异类型鉴定  29-30    3.2.6 克隆测序  30-31    3.2.7 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)  31-32      3.2.7.1 小麦成熟籽粒中RNA 的提取  31      3.2.7.2 cDNA 第一链的合成及RT-PCR 反应  31-32    3.2.8 统计分析  324 结果与分析  32-53  4.1 黄淮麦区供试小麦品种籽粒硬度表型和基因型鉴定  32-36    4.1.1 硬度表型分布  32-34    4.1.2 Puroindoline -D1 变异类型的鉴定  34-36  4.2 黄淮麦区小麦新品系硬度表型和其变异类型的分布  36-38  4.3 PINA 蛋白缺失类型的分子机理研究及其功能性标记开发  38-41    4.3.1 供试材料硬度基因型鉴定  38-39    4.3.2 覆盖PINA 缺失区域特异性引物的设计  39-40    4.3.3 一种PINA 蛋白缺失新类型的发现  40-41  4.4 Puroindoline b-2v 基因在黄淮麦区的分布及与产量性状的关系  41-51    4.4.1 Puroindoline b-2v 基因的分子鉴定  41-44    4.4.2 Puroindoline b-B2v 基因与产量相关性状的关系  44-49    4.4.3 黄淮麦区小麦新品系中Puroindoline b-2v 的分布及其对产量性状的影响  49-51  4.5 不同Puroindoline b-B2v 变异类型的表达量分析  51-53    4.5.1 RNA 及cDNA 检测结果  51-52    4.5.2 溶解曲线及标准曲线方程的建立  52-53    4.5.3 Puroindoline b-B2v 基因特异性表达  535 结论与讨论  53-58  5.1 混合型小麦品种的SKCS  53-54  5.2 黄淮麦区Puroindoline -D1 变异类型对小麦品质改良的影响  54-55  5.3 PINA 蛋白缺失类型及Pina-D1b 标记的开发  55-56  5.4 Puroindoline b-B2 位点及其与小麦产量相关性状的关系  56-57  5.5 荧光定量 PCR 在基因表达分析上的应用  57-58参考文献  58-67ABSTRACT  67-70硕士期间发表文章  70

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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