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吉富罗非鱼精原干细胞分离与体外培养的研究

作　者: 王爱珍
导　师: 安立龙
学　校: 广东海洋大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 吉富罗非鱼 精原干细胞 饲养层 增殖 冷冻保存
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


精子的发生是一个复杂而精细的过程，精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）在雄性性腺中受神经内分泌和环境因子的协同作用而有条不紊的进行自我更新和分化，以维持机体正常的生精功能。精子作为向子代传递遗传信息的载体是进行遗传物质改良的最好材料，而生殖干细胞又是形成精子的前提细胞，可利用基因工程技术生产饲料转化率高、抗病力强及具有优质蛋白质的转基因动物。尽管人们对精子发生的一般过程和调节机制有所了解，但对多数动物精子发生的特点和调节机制仍然认识不清楚。因此在体外模拟雄性动物性腺微环境培养SSCs对揭秘精子的发生过程和调节机制具有重要意义，为体外生产精子并以精子为载体生产转基因细胞、组织和动物提供材料和技术，不仅可保护濒临灭绝的遗传资料也可以生产具有商业价值的新品种或转基因动物。哺乳动物SSCs体外分离、克隆及诱导等的研究取得了较大的进展，而鱼类SSCs的研究仅限于斑马鱼和青鳉鱼等少数鱼类，国内罗非鱼SSCs体外分离培养的相关研究鲜有报道，关于罗非鱼SSCs分离、克隆及冻存的方法还需进一步优化和探讨，因此本研究以雄性吉富罗非鱼为模型动物，取精巢为试验材料做如下研究：1.采用不同消化液和不同分离方法获得SSCs和SCs，探讨CO2和Hepes浓度对罗非鱼精巢细胞原代培养时的影响，然后从形态学及HE、油红O及AKP染色等方法对SSCs和SCs做初步的鉴定；2.用差速贴壁法、克隆环法和机械法对SSCs和SCs进行纯化，用不同饲养层培养罗非鱼SSCs并选择出有利于SSCs增殖的饲养层，然后探讨分别添加吉富罗非鱼精巢提取液、斑马鱼胚胎提取液、EGF或bFGF时，对以SCs为饲养层培养的SSCs增殖的影响，并绘制生长曲线，以建立吉富罗非鱼SSCs的扩增体系；3.用不同的冻存液和降温方式冻存吉富罗非鱼SSCs和SCs，然后用相同的方法解冻并检测SSCs和SCs的解冻存活率，最后选择出有利于SSCs和SCs冷冻保存的冻存液和降温方式。试验结果表明：1．用胰蛋白酶消化吉富罗非鱼精巢组织后所得的总细胞数和活细胞数都显著高于0.1%胶原酶Ⅳ和0.04%EDTA·Na2（P<0.05），而首次贴壁时间比0.1%胶原酶Ⅳ和0.04%EDTA·Na2组明显缩短（P<0.05）；胰蛋白酶组与组合酶（胶原酶和胰蛋白酶，下同）组相比总细胞数、活细胞数和首次贴壁时间都无显著差异（P>0.05），但胰蛋白酶组消化时间比三个组都短，因此用胰蛋白酶可高效、快速的分离到吉富罗非鱼精巢细胞，用L-15+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L谷氨酰胺+1mmol/L非必需氨基酸+1%罗非鱼血清+10%FBS培养分离的细胞，由于组织块培养后得到的杂细胞较多，进一步纯化SSCs和SCs较困难因而不宜采用；添加5%CO2浓度时不利于吉富罗非鱼SSCs和SCs的生长，SSCs和SCs培养的前3d宜在pH为7.2-7.4的培养液中生长，随着培养时间的延长，较高的pH更有助于SSCs和SCs的增殖。经鉴定胰蛋白酶分离所得的细胞主要为SSCs和SCs，显微镜观察和HE染色发现SSCs依附在SCs上呈圆形或卵圆形，体积较大，胞质透明并以集落形式生长，油红O染色发现SSCs胞质中几乎没有脂滴，AKP染色呈阳性，而SCs呈三角形或多边形，胞质中含有丰富的脂滴，AKP阴性不着色。2．采用机械法纯化后SSCs和SCs的纯度分别为85%和88%；当有60%-70%SCs贴壁时可对其进行传代，一般3-4d传一代，SCs共传了5代；当饲养层上有大量SSCs集落时对SSCs进行传代，发现原代培养至第5-6d时是SSCs传代培养的最佳时期。由于SSCs增殖缓慢，一般7d传一代，已传至第5代，隔3d换一半的培养液，传代过程中SSCs和SCs均保持原来的形态。SCs饲养层与小鼠胎儿成纤维细胞和大鼠胰腺上皮样细胞饲养层相比显著促进SSCs增殖（P<0.05），而后两种饲养层几乎对SSCs的增殖没有影响，反而随着培养时间的延长抑制其生长。以L-15+1%罗非鱼血清+10%FBS为基础培养液，SCs为饲养层，分别添加不同浓度的罗非鱼精巢提取液、斑马鱼胚胎提取液、EGF或bFGF扩增吉富罗非鱼SSCs，采用CCK-8法测定第1-7d的细胞的光密度，绘制细胞生长曲线。结果显示上述添加物均能促进SSCs增殖，其中添加10%斑马鱼胚胎提取液、10ng/mL EGF或10ng/mLbFGF时显著促进SSCs增殖，以10ng/mL EGF和10ng/mL bFGF促增殖效果最为明显，而10ng/mL bFGF稍微优于10ng/mL EGF。3．冻存液为胎牛血清:DMSO=9:1和降温条件为4℃30min→-20℃1h→-80℃过夜（12h）→投入液氮时吉富罗非鱼SSCs可以较好的冻存，平均解冻存活率为78%。降温条件为4℃30min→-20℃1h→-80℃的过夜（12h）→投入液氮时，冻存液为胎牛血清:DMSO=9:1和胎牛血清:DMSO:培养液A=1:1:8都可用来冷冻吉富罗非鱼SCs，复苏率分别为82.5%和79%。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
1 文献综述  11-25
  1.1 精原干细胞的研究进展  11-15
    1.1.1 精原干细胞在动物体内的起源和分类  12-13
    1.1.2 精原干细胞的生物学特性  13-15
  1.2 鱼类性腺的发育及精子的发生  15-18
    1.2.1 鱼类性腺的发育  15-16
    1.2.2 鱼类精巢的结构  16-17
    1.2.3 鱼类精子的发生  17-18
  1.3 鱼类精原干细胞分离、培养、鉴定及冻存研究进展  18-22
    1.3.1 鱼类精原干细胞的分离  18-19
    1.3.2 鱼类精原干细胞的纯化  19
    1.3.3 鱼类精原干细胞的培养  19-20
    1.3.4 精原干细胞的鉴定  20-21
    1.3.5 鱼类精原干细胞冷冻保存  21-22
  1.4 精原干细胞诱导分化及应用  22-25
    1.4.1 鱼类精原干细胞的诱导分化  22-23
    1.4.2 哺乳动物精原干细胞的诱导分化  23
    1.4.3 鱼类精原干细胞的应用  23-24
    1.4.4 本研究的目的和意义  24
    1.4.5 研究的创新之处  24-25
2 吉富罗非鱼精原干细胞分离、克隆方法  25-38
  2.1 材料与方法  25-30
    2.1.1 主要试剂配制及仪器  25-27
    2.1.2 吉富罗非鱼精巢细胞的分离方法  27-29
    2.1.3 培养条件对吉富罗非鱼精巢细胞原代培养的影响  29
    2.1.4 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的鉴定  29-30
  2.2 数据统计  30
  2.3 结果与分析  30-35
    2.3.1 不同消化液对吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的影响  30-31
    2.3.2 不同分离方法分离吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的效果  31
    2.3.3 培养条件对吉富罗非鱼精巢细胞原代培养的影响  31-32
    2.3.4 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的鉴定  32-35
  2.4 讨论  35-37
    2.4.1 消化液和分离方法对精巢细胞的影响  35-36
    2.4.2 培养条件对吉富罗非鱼对吉富罗非鱼精巢细胞原代培养的影响  36
    2.4.3 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的鉴定  36-37
  2.5 小结  37-38
3 吉富罗非鱼精原干细胞扩增体系的筛选和建立  38-52
  3.1 材料与方法  38-42
    3.1.1 主要试剂配制及仪器  38-39
    3.1.2 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的纯化方法  39-40
    3.1.3 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的传代培养及饲养层的制备  40-41
    3.1.4 不同饲养层对吉富罗非鱼精原干细胞生长特性的影响  41
    3.1.5 添加物对吉富罗非鱼精原干细胞增殖的影响  41-42
  3.2 数据统计  42
  3.3 结果与分析  42-48
    3.3.1 纯化方法对吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的影响  42-43
    3.3.2 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞传代培养的生长行为  43-44
    3.3.3 不同饲养层对吉富罗非鱼精原干细胞增殖的影响  44-45
    3.3.4 添加物对吉富罗非鱼精原干细胞增殖的影响  45-48
  3.4 讨论  48-51
    3.4.1 纯化方法对吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的影响  48-49
    3.4.2 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的传代培养及其饲养层的影响  49
    3.4.3 添加物对吉富罗非鱼精原干细胞增殖的影响  49-51
  3.5 小结  51-52
4 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的冻存方法  52-57
  4.1 材料与方法  52-54
    4.1.1 主要试剂配制及仪器  52-53
    4.1.2 吉富罗非鱼精巢精原干细胞冻存条件的探讨  53
    4.1.3 吉富罗非鱼精巢支持细胞冻存条件的探讨  53
    4.1.4 吉富罗非鱼精巢精原干细胞的解冻及解冻存活率的检测  53-54
    4.1.5 吉富罗非鱼精巢支持细胞的解冻  54
  4.2 数据统计  54
  4.3 结果与分析  54-55
    4.3.1 不同冻存液对吉富罗非鱼精巢精原干细胞冷冻保护效果的影响  54
    4.3.2 不同降温处理对吉富罗非鱼精巢精原干细胞冷冻保护效果的影响  54-55
    4.3.3 不同冻存液对吉富罗非鱼精巢支持细胞冷冻保护效果的影响  55
    4.3.4 不同降温处理对吉富罗非鱼精巢支持细胞冷冻保护效果的影响  55
  4.4 讨论  55-56
  4.5 小结  56-57
5 结论  57-58
参考文献  58-71
附录  71-72
致谢  72-73
作者简介  73-74
导师简介  74-75

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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