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家蚕核型多角体病毒BmNPV39k启动子的分析与改造

作　者: 匡秀秀
导　师: 潘敏慧; 鲁成
学　校: 西南大学
专　业: 微生物学
关键词: BmNPV 39k启动子 hr3 polh-up shRNA
分类号: S884.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

家蚕是一种具有重要经济价值的昆虫,为世界经济发展、文化传播做出了重要贡献。家蚕血液型脓病是由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, BmNPV)感染家蚕引起的一种传染性蚕病,给蚕业生产带来了巨大危害,提高家蚕品种对BmNPV的抗性是抗病育种的主要目标。近年来,转基因RNA干涉技术兴起,该技术结合转基因和RNAi的优势,有望成为培育家蚕抗病毒品种的有效途径。利用强组成型启动子能诱发产生更多siRNA,提高RNAi效率,但是外源基因片段在组成型启动子的驱动下,持续高量表达,不仅造成生物体内资源的浪费,而且对生物体产生副作用,因此,只有在病源感染条件下才会驱动外源基因表达的诱导型启动子逐渐成为研究热点,在培育家蚕抗性新品种时,筛选一个高效合适的病毒诱导型启动子显得尤为重要。本研究的主要目的就是为家蚕转基因RNA干涉BmNPV筛选一个高效的诱导型启动子,为获得家蚕抗BmNPV的转基因素材奠定前期基础。本文对BmNPV诱导型启动子进行了筛选,获得了BmNPV诱导型启动子,并对其进行改造,构建了基于该启动子驱动的转基因干涉载体。主要研究结果如下：1BmNPV启动子的选择与克隆根据文献报道和杆状病毒的级联调控特征,参照BmNPV基因功能,初步确定了Bm122、Bm21、P143、39k、P33、VP1054、P6.9这7个病毒基因的启动子作为筛选病毒诱导型启动子的对象。根据NCBI公布的BmNPV(T3株)基因组序列,分析并克隆了7个基因ATG上游800-1000bp区域作为启动子序列,成功构建萤火虫荧光素酶重组质粒PGL3-Bm122,PGL3-Bm21,PGL3-P143, PGL3-39k, PGL3-P33, PGL3-VP1054,PGL3-P6.9。重组质粒与内参质粒P-IE1-Rlucp共转染家蚕BmN-SWU1细胞,运用双荧光素酶报告基因检测系统,分析启动子的转录活性。结果显示：与未感染组相比,BmNPV感染72h后,上述7个基因启动子的荧光素酶相对比值均有不同程度的上调,表明BmNPV感染能提高上述启动子的转录活性,其中39k启动子感染前后提高了71.9倍,启动子的病毒诱导转录活性在上述启动子中最高。由此,将39k启动子作为进一步研究的对象。239k启动子的序列特征与功能分析对39k启动子进行序列分析,发现其序列中含有增强子类似元件[检索模式为A (A/T) CGT(G/T),即CGTGC]、加帽位点(CAGT-motif,是立即早期、延迟早期基因必须的特征性序列)和TATA盒基元序列,符合真核生物启动子特点。采用PCR法对39k启动子5’端UTR进行分段缺失,构建缺失质粒转染BmN-SWU1细胞,测定BmNPV感染后24h、48h、72h相对酶活,确定了39k启动子转录活性最高的区段是克隆的全长启动子序列,对转录活性起至关重要的区段位于TSS (Transcription Start Site)上游-610--419bp处；39k启动子的基础转录活性区域位于TSS上游-419至TSS下游31bp处。将全长39k启动子质粒PGL3-773luc转染BmN-SWU1细胞,测定BmNPV感染后24h、48h、72h相对酶活,探讨39k启动子的转录时相。结果表明,在病毒感染24h及以后的各时间点,39k启动子活性逐渐提高,72h达到最大,72h与24h相比,相对酶活差异极其显著(P<0.01),与48h相比,相对酶活有显著性差异(P<0.05),这符合39k基因是延迟早期基因的特点,并且39k启动子的转录活性在感染BmNPV后24h-72h内具有时间累积效应。339k启动子的改造杆状病毒的同源重复区hr (homologous regions, hrs)是一种普遍使用的增强元件,杆状病毒多角体上游基因polh-up (pu)被证实同样能够增强启动子转录。将BmNPV来源的hr3、hr5、polh-up (pu)、hr3-pu克隆至39k全长启动子上游,以Bmactin基因启动子A4启动子作为阳性对照,分析各个增强元件的增强效果。瞬时转染实验表明：无BmNPV感染时,39k、hr3-39k、hr5-39k、pu-39k、hr3-pu-39k启动子转录活性极低；BmNPV感染后,39k、hr3-39k、hr5-39k、pu-39k、hr3-pu-39k启动子荧光素酶相对比值不同程度地上调,具有BmNPV诱导转录活性；hr3的增强效果要强于pu、hr5,与39k启动子相比,相对酶活提高了4.38倍；hr3和pu共同作用,增强作用更加明显,与39k启动子相比,酶活提高了14.3倍；与组成型强启动子A4相比,相对酶活提高了2.147倍。上述结果表明polh和hr3联合作用,能够显著提升BmNPV39k启动子的转录活性。与此同时,上述39k启动子驱动DsRed表达,转染BmN-SWU1细胞,DsRed发光情况与荧光素酶活性分析的结果一致。由此确定hr3-polh的增强作用最强,hr3-polh-39k启动子将用于后续RNAi研究。4细胞水平检测39k启动子shRNA干涉效果为了检测hr3-pu-39k启动子能否在家蚕细胞水平驱动shRNA转录,诱发RNA干涉,从而实现特异性的基因沉默,设计合成3条特异性针对BmNPV lef-1基因的特异性靶标序列,由hr3-pu-39k启动子驱动,分别构建PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA干涉载体和PGL3-A4-luc-lef-1表达载体。PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA、PGL3-A4-luc-lef-1和内参质粒P-IEl-Rlucp共转染BmN-SWUl细胞,感染后72h收集细胞,检测荧光素酶活性BmNPV感染后72h,实验组(PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA)的荧光素酶相对比值与对照组相比,明显下降。实验组感染前后,相对酶活差异性极其显著(P<0.01),干扰序列能在mRNA水平抑制lef-1基因的表达,抑制效果高达85%以上,表明在细胞水平,BmNPV能够诱导39k启动子驱动shRNA载体表达转录生成足够的siRNA,一定程度上抑制BmNPV基因的转录。

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-13
第一章文献综述  13-25
  1.1 昆虫杆状病毒概述  13-15
    1.1.1 杆状病毒的分类及生活周期  13
    1.1.2 杆状病毒的分子结构研究进展  13-14
    1.1.3 家蚕核型多角体病毒的危害与防治  14-15
  1.2 启动子的研究  15-20
    1.2.1 启动子的结构和功能  15-16
    1.2.2 启动子的分类  16-17
    1.2.3 启动子的研究方法及应用  17-18
    1.2.4 昆虫启动子的研究及应用  18-20
  1.3 利用RNAi进行家蚕抗病育种研究进展  20-25
    1.3.1 RNAi的作用机制  20-21
    1.3.2 siRNA的生成途径  21-25
第二章引言  25-29
  2.1 研究背景  25
  2.2 研究意义  25-26
  2.3 研究内容  26-27
    2.3.1 BmNPV启动子的选择与克隆  26
    2.3.2 启动子活性检测  26
    2.3.3 39k启动子的序列与功能分析  26
    2.3.4 39k启动子的优化与改造  26-27
    2.3.5 家蚕细胞水平检测39k启动子shRNA干涉效果  27
  2.4 技术路线  27-29
第三章候选启动子的确定  29-39
  3.1 材料试剂和方法步骤  29-31
    3.1.1 材料试剂  29-30
    3.1.2 主要仪器  30
    3.1.3 主要试剂的配制  30-31
  3.2 方法步骤  31-35
    3.2.1 PCR扩增  32
    3.2.2 PCR产物回收  32-33
    3.2.3 目的片段与PGL3-Basic酶切纯化  33
    3.2.4 目的片段与PGL3-Basic连接  33
    3.2.5 连接产物转化  33
    3.2.6 阳性克隆斑的筛选  33-34
    3.2.7 阳性克隆斑的验证  34
    3.2.8 测序验证  34
    3.2.9 细胞转染  34
    3.2.10 启动子活性检测  34-35
  3.3 结果与分析  35-38
    3.3.1 启动子的选择  35
    3.3.2 启动子活性检测  35-37
    3.3.3 确定候选启动子  37-38
  3.4 小结与讨论  38-39
第四章 BmNPV 39k启动子结构与功能  39-49
  4.1 材料试剂与方法步骤  39-40
    4.1.1 材料试剂  39
    4.1.2 方法步骤  39-40
  4.2 结果与分析  40-46
    4.2.1 BmNPV 39k启动子的克隆及序列分析  40-42
    4.2.2 BmNPV 39k启动子功能分析  42-46
  4.3 小结与讨论  46-49
    4.3.1 39k启动子的BmNPV诱导型转录  46-47
    4.3.2 39k启动子的重要区段-610～-419bp  47-49
第五章 39k启动子的改造  49-63
  5.1 材料试剂与方法步骤  49
    5.1.1 材料试剂  49
  5.2 方法步骤  49-50
    5.2.1 载体构建  49-50
    5.2.2 荧光素酶相对比值的测定  50
  5.3 结果与分析  50-60
    5.3.1 重组质粒的构建  50-52
    5.3.2 hr3对39k启动子转录的增强作用  52-53
    5.3.3 hr5对39k启动子转录的增强作用  53-54
    5.3.4 polh-up对39k启动子转录的增强作用  54-55
    5.3.5 BmNPV polh-up、hr3联合对39k启动子转录的增强作用  55-58
    5.3.6 改造39k启动子驱动DsRed基因的表达与分析  58-60
  5.4 小结与讨论  60-63
    5.4.1 pu、hr3、hr5的增强作用  60-63
第六章细胞水平39k启动子shRNA干涉效果检测  63-71
  6.1 材料试剂和方法步骤  63-65
    6.1.1 材料试剂  63
    6.1.2 方法步骤  63-65
  6.2 结果与分析  65-69
    6.2.1 BmNPV 39k启动子PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA干涉载体构建  65-67
    6.2.2 家蚕A4启动子表达载体PGL3-A4-luc-lef-1构建  67
    6.2.3 干涉效果检测  67-69
  6.3 小结与讨论  69-71
    6.3.1 靶基因干涉序列的设计选择  69
    6.3.2 启动子的选择  69-71
第七章总结  71-73
  7.1 诱导型启动子39k启动子的筛选与克隆  71
  7.2 39k启动子的生物信息分析、缺失分析、转录时相分析  71
  7.3 39k启动子的优化与改造  71-72
  7.4 shRNA载体的构建和细胞水平干涉效果检测  72-73
参考文献  73-79
附录  79-81
致谢  81-83
发表论文及参加课题一览表  83

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 蚕桑 > 蚕的病虫害及其防治 > 病毒病（脓病）
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