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犬γ干扰素的可溶表达及其产物的活性鉴定

作　者: 韩阳
导　师: 李德山
学　校: 东北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: CaIFN-γ SUMO MTT P53
分类号: S858.292
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

干扰素是一种多功能的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等功能，分为I和II两个型。I型IFN包括α、β、ω等亚型，而II型IFN则只有γ一个型。IFN-α主要由白细胞产生，与IFN-β,IFN-ω作用于同一受体，而IFN-γ主要由NK细胞、CD4+Th1细胞以及CD8+T细胞产生。近年来，犬病毒性疾病在全球范围内呈现出越来越严重的趋势，狂犬病、犬细小病毒病等有些病毒是人畜共患病的病原，给人们带来了不小的危害，已经引起全社会的关注。因此，从兽医和人医临床角度出发，综合控制犬病毒性疾病意义重大。干扰素能够通过阻断病毒的繁殖及复制，具有良好的临床疗效，因此研究有关犬干扰素的生物制品势在必行。但是，目前利用原核系统表达的犬干扰素-γ(CaIFN-γ)多以包涵体形式存在，为无生物学活性的蛋白质，需要经过体外重新折叠复性后才能恢复为具有生物活性的干扰素，但是包涵体复性效率低，而且复性后蛋白的活性并不能得到保证，这成为犬干扰素-γ大量制备和应用于实践的瓶颈问题。因此，本文对犬γ干扰素的可溶表达进行探讨，旨在可溶性表达目的基因CaIFN-γ，获得具有生物活性的CaIFN-γ蛋白。近年来研究发现SUMO可作为分子伴侣来增加外源蛋白的稳定性和可溶性，其作用机理可能是SUMO蛋白作为一个高度疏水的核心，为目的蛋白的折叠提供成核位点，促进蛋白间的相互作用并使其正确折叠，最终增强了融合蛋白的可溶性。本研究采用SUMO融合表达系统，经IPTG诱导后电泳结果显示：在超声破碎后的上清中有大部分的目的蛋白表达。进而在实验过程中对诱导时间、诱导剂浓度及诱导温度等表达条件进行了优化，发现诱导时间对CaIFN-γ蛋白表达量影响较大，在诱导4h时蛋白表达量较高。而IPTG浓度对此融合蛋白表达影响较小，为了减少对菌体的伤害，本实验选择了0.25mmol/L的IPTG浓度。温度变化对该蛋白表达也有影响，在20℃时菌体生长较慢蛋白表达量也较低，因此本实验选择了常规诱导温度37℃。在最优的表达条件下：当菌株处于对数生长期，选择诱导剂终浓度为0.25mmol/L、诱导温度为37℃、诱导时间为4h，产物量及表达量达到最优，破碎后SDS-PAGE分析蛋白表达量，上清中蛋白含量占菌体蛋白总量的50%，这与以往利用其它表达载体表达CaIFN-γ相比，大大提高了蛋白的可溶性表达，解决了包涵体变性复性影响蛋白活性的瓶颈问题，为以后CaIFN-γ的研究及大规模发酵生产奠定了基础。传统方法在检测犬干扰素活性时，一般采用MDCK-VSV检测系统，VSV病毒本身存在危险性，导致猪，牛等哺乳动物和人共感染，并且培养病毒时还存在潜在危险性，病毒会出现不可预测的变异，导致毒力改变，而且检测TCID50时费时费力，因此本研究建立了一种安全、快速、灵敏的犬γ干扰素活性检测方法，也为今后更好的研究干扰素的抗病毒、抗肿瘤活性的作用机理奠定基础。本文以MDCK细胞为靶细胞，采用MTT法检测犬γ干扰素对该细胞增殖的抑制作用。结果表明，犬干扰素-γ对MDCK细胞呈明显的抑制作用。流式细胞仪检测CaIFN-γ蛋白有效诱导MDCK细胞发生凋亡和坏死，结果表明CaIFN-γ蛋白能够显著诱导MDCK细胞发生凋亡。 Real-time PCR法检测犬γ干扰素刺激MDCK细胞后，细胞内源p53mRNA水平的变化，结果显示，p53的表达量与犬γ干扰素的剂量和时间呈依赖性关系。通过以上方法说明我们所表达的可溶性CaIFN-γ蛋白是具有生物活性的。本研究建立了犬γ干扰素的可溶表达方法并建立一种快速、方便的犬γ干扰素活性检测方法，为进一步研究及生产犬γ干扰素奠定了基础。

全文目录

摘要  10-12
Abstract  12-14
1 前言  14-21
  1.1 干扰素的分类  14
  1.2 IFN-γ的结构及理化性质  14-15
  1.3 IFN-γ的受体及分布  15
  1.4 IFN-γ的诱导产生  15
  1.5 IFN-γ的生物学特性  15-16
  1.6 IFN-γ的生物学功能  16-18
    1.6.1 抗病毒活性  16
    1.6.2 抗肿瘤和抗增殖活性  16-17
    1.6.3 免疫调节活性  17
    1.6.4 抗细菌、寄生虫作用  17-18
    1.6.5 治疗类风湿性关节炎  18
    1.6.6 治疗皮肤疾病  18
    1.6.7 治疗眼科疾病  18
  1.7 干扰素基因工程研究进展  18-19
  1.8 大肠杆菌表达系统简介  19
  1.9 包涵体的形成  19
  1.10 SUMO 标签的优势  19-20
  1.11 研究目的及意义  20-21
2 材料  21-24
  2.1 细胞株及菌株  21
  2.2 载体  21
  2.3 酶及生化试剂  21
  2.4 引物  21-22
  2.5 主要仪器和设备  22-24
3 方法  24-35
  3.1 CaIFN-γ基因的克隆与序列分析  24-28
    3.1.1 犬脾总 RNA 的提取  24
    3.1.2 CaIFN-γ基因 cDNA 的合成  24-25
    3.1.3 CaIFN-γ成熟基因的 PCR 扩增  25
    3.1.4 CaIFN-γ PCR 产物胶回收  25
    3.1.5 CaIFN-γ胶回收产物与载体 PMD 18 T-Vector 的连接  25-26
    3.1.6 E.coil 感受态细胞 DH5α的制备  26
    3.1.7 连接产物转化至感受态细胞 DH5α  26
    3.1.8 重组阳性克隆的筛选  26-27
    3.1.9 重组阳性质粒 pMD-CaIFN-γ的鉴定  27
    3.1.10 CaIFN-γ成熟多肽基因 cDNA 序列测定与结果分析  27-28
  3.2 重组表达载体 pSUMO-CaIFN-γ构建  28-29
    3.2.1 与 pSUMO 表达载体连接的 CaIFN-γ插入片段的制备  28
    3.2.2 CaIFN-γ基因与 SUMO 表达载体的连接  28
    3.2.3 重组表达载体的转化  28-29
    3.2.4 阳性重组质粒的筛选及鉴定  29
  3.3 CaIFN-γ蛋白的表达  29-30
    3.3.1 pSUMO-CaIFN-γ重组质粒在大肠杆菌中的表达  29
    3.3.2 pSUMO-CaIFN-γ重组质粒的诱导条件的优化  29-30
    3.3.3 重组 CaIFN-γ融合蛋白表达量分析  30
  3.4 CaIFN-γ蛋白的纯化  30-31
    3.4.1 Ni-NTA 纯化柱的平衡  30-31
    3.4.2 融合蛋白的纯化  31
    3.4.3 成熟 CaIFN-γ的纯化  31
  3.5 细胞培养  31-32
    3.5.1 细胞复苏  31
    3.5.2 细胞传代  31-32
    3.5.3 细胞冻存  32
  3.6 MTT 法检测重组 CaIFN-γ蛋白对 MDCK 增殖的抑制作用  32
  3.7 Annexin V/PI 双染法检测 CaIFN-γ蛋白诱导 MDCK 细胞凋亡  32
  3.8 Real-time PCR 检测 CaIFN-γ蛋白对调 MDCK 细胞 p53 mRNA 水平的影响  32-35
4 结果  35-45
  4.1 CaIFN-γ基因的克隆与序列分析  35-37
    4.1.1 犬脾 CDNA 的获得  35
    4.1.2 CaIFN-γ基因 cDNA 的 RT-PCR 扩增  35-36
    4.1.3 重组质粒 pMD-CaIFN-γ的鉴定  36
    4.1.4 阳性重组质粒 pMD-CaIFN-γ的测序结果分析  36-37
  4.2 重组表达载体 pSUMO-CaIFN-γ构建  37-38
    4.2.1 CaIFN-γ插入片段的胶回收  37
    4.2.2 阳性重组质粒的鉴定  37-38
  4.3 CaIFN-γ蛋白的表达  38-41
    4.3.1 重组质粒 pSUMO-CaIFN-γ转化菌的诱导  38-39
    4.3.2 CaIFN-γ蛋白诱导条件的优化  39-41
    4.3.3 重组 CaIFN-γ融合蛋白表达量分析  41
  4.4 CaIFN-γ蛋白的纯化  41-42
    4.4.1 融合蛋白的纯化  41
    4.4.2 pSUMO-CaIFN-γ成熟蛋白的纯化  41-42
  4.5 MTT 法检测重组 CaIFN-γ蛋白对 MDCK 增殖的抑制作用  42-43
  4.6 流式细胞仪检测 CaIFN-γ蛋白诱导 MDCK 细胞发生凋亡和坏死  43
  4.7 Real-time PCR 检测 CaIFN-γ蛋白上调 MDCK 细胞 p53mRNA 表达水  43-45
5 讨论  45-51
  5.1 蛋白的可溶性表达  45-46
  5.2 培养条件对蛋白表达量的影响  46-47
  5.3 CaIFN-γ蛋白生物活性的检测  47-50
    5.3.1 干扰素检测的传统方法  47-48
    5.3.2 MTT 方法检测 CaIFN-γ抑制 MDCK 细胞增殖，并促进其凋亡  48-49
    5.3.3 应用 Annexin V/PI 双染法检测 CaIFN-γ蛋白对 MDCK 细胞发生凋亡和坏死的影响  49
    5.3.4 CaIFN-γ上调 MDCK 细胞内 P53 的表达  49-50
  5.4 展望  50-51
6 结论  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-56
附录 A  56-57
附录 B  57-58
附录 C  58-59
攻读学位期间发表的学位论文  59

犬γ干扰素的可溶表达及其产物的活性鉴定

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