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猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离及鉴定

作　者: 姜春霞
导　师: 李一经
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒分离鉴定
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）作为一种病原引起猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis，TGE)。该病在临床诊断方面的主要病理特征表现为呕吐、水样腹泻和严重脱水，属于猪的一种高度接触性和急性传染病。本病对各年龄段的猪都易感，可引起两周龄以下的仔猪死亡，致死率高达100%。该病流行范围广，发病和致死率极高，是我国及世界其他国家仔猪死亡的重要疫病，给养猪业造成了巨大的经济损失。对TGE的防制主要以疫苗免疫预防为主。由于TGEV分离培养相对困难，初代分离的病毒难以适应细胞，病毒繁殖滴度低及产量低，是目前对该病毒研究所面临的主要问题，因此流行毒株的分离培养并获得稳定适应细胞的TGEV地方毒株，是研制TGE疫苗的重要物质基础。本实验对黑龙江省某猪场腹泻仔猪的粪便通过核酸提取及RT-PCR鉴定，用TGEV的S基因引物扩增到一段约480bp的基因序列，同时用PRV及PEDV的引物进行RT-PCR没有扩增到目的基因，将扩增到的目的基因测序，结果表明该基因序列与TGEV TH-98株的S基因核苷酸序列同源性为98.5%，表明发病猪场腹泻仔猪的粪便中含有TGE病毒。将该粪便病料经离心、过滤后进行病毒分离，在原代猪肾和猪睾丸细胞上分别盲传8代后细胞出现病变；通过超薄切片电镜观察，普通电镜观察，免疫电镜观察确定了该病毒的形态是有囊膜的冠状病毒，直径大小在80～100nm，将该病毒分离株命名为TGEV LJ-12株。间接免疫荧光实验，间接ELISA实验可见盲传9代后的细胞培养毒均出现了特异性的阳性反应。通过提取病变细胞培养液中的病毒RNA，使用套式PCR方法扩增出TGE病毒S基因的一段长约384bp的序列，将序列与GenBank上发表的多株流行毒株进行比较，可见TGEV LJ-12株该段基因的核苷酸序列同源性均达到94%以上。根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒基因序列，使用套式PCR方法，设计了针对N基因的特异性外套引物P1/P2，内套引物N1/N2和N3/N4，P1/P2扩增长度为1167bp，N1/N2和N3/N4分别为475bp和476bp。对原代猪肾细胞繁殖的TGEV LJ-12株病毒进行RT-nested-PCR检测，通过DNAStar软件与多株序列比较，结果显示扩增得到的TGEV LJ-12株N基因的两段序列同源性均达到94%以上，经原代猪肾细胞繁殖至20代仍可以检测到，表明该病毒已经分离成功并已适应在原代细胞上繁殖。应用经原代猪肾细胞繁殖至15代的细胞培养毒进行动物实验，对刚出生未哺乳的SPF巴马香猪灌服20mL细胞培养毒，实验猪在第8天死亡，对其粪便和小肠进行RT-nested-PCR方法检测，可见攻毒仔猪从第三天开始排毒，粪便中可检测到特异性的RT-PCR反应带，均在内套PCR出现与预期结果相符合的约475bp的N基因目的条带。测序结果表明，与灌服之前的细胞培养毒的基因序列比较，序列未发生变化；通过免疫荧光检测方法对其肠系膜淋巴结进行检测，可见明亮的荧光，两种检测结果一致，说明实验猪是因病毒感染死亡。猪传染性胃肠炎病毒地方流行毒株TGEV LJ-12株的成功分离，为该病的流行病学、实验室诊断及和病毒的生物学特征以及猪传染性胃肠炎疫苗生产毒株的储备等进一步研究奠定了物质基础。

全文目录

目录  4-6
CONTENTS  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-23
  1.1 TGE 的流行性及危害性  12-13
  1.2 TGEV 的病原学特征  13-15
    1.2.1 TGEV 的病毒学分类地位  13
    1.2.2 TGEV 形态学特性  13-14
    1.2.3 TGEV 的培养特性  14
    1.2.4 TGEV 的抗原性和变异性  14-15
    1.2.5 TGEV 的理化特性  15
  1.3. TGE 临床症状  15
  1.4 TGEV 分子生物学研究进展  15-18
    1.4.1 TGEV 的基因组结构  15-16
    1.4.2 TGEV 的结构基因  16-18
    1.4.3 TGEV 的非结构基因  18
  1.5 TGE 的诊断技术  18-21
    1.5.1 病毒的分离和鉴定  18-19
    1.5.2 免疫学检测方法  19-20
    1.5.3 分子生物学检测方法  20-21
  1.6 研究的目的和意义  21-23
2 材料及方法  23-30
  2.1 实验材料  23-25
    2.1.1 TGEV 分离用病料  23
    2.1.2 细胞与病毒  23
    2.1.3 实验动物  23
    2.1.4 引物  23-24
    2.1.5 主要试剂  24
    2.1.6 仪器设备  24-25
    2.1.7 主要试剂配方  25
  2.2 实验方法  25-30
    2.2.1 病毒分离和部分结构基因的扩增  25-27
    2.2.2 TGEV-LJ12 分离株的鉴定  27-28
    2.2.3 ELISA 方法鉴定病毒  28-29
    2.2.4 动物实验  29-30
3 结果  30-40
  3.1 原代细胞培养  30-31
    3.1.1 猪肾原代细胞培养  30
    3.1.2 猪睾丸原代细胞培养  30-31
  3.2 病料分离鉴定结果  31
  3.3 病毒培养  31-32
  3.4 间接免疫荧光检测结果  32
  3.5 电镜观察结果  32-33
    3.5.1 细胞超薄切片电镜观察结果  32-33
    3.5.2 直接负染电镜法观察病毒结果  33
    3.5.3 免疫电镜观察结果  33
  3.6 间接 ELISA 检测结果  33-34
  3.7 S 基因部分序列的比较  34-35
    3.7.1 RT-nested-PCR 鉴定 S 基因的扩增结果  34
    3.7.2 S 基因部分序列与其他流行毒株的比较  34-35
  3.8 N 基因部分序列的比较  35-38
    3.8.1 RT-nested-PCR 鉴定 N 基因的扩增结果  35-36
    3.8.2 N 基因部分序列与其他流行毒株的比较  36-37
    3.8.3 RT-nested-PCR 鉴定细胞培养病毒  37-38
  3.9 检测实验动物粪便样品及小肠组织结果  38-40
    3.9.1 RT-nested-PCR 方法检测实验动物粪便样品及小肠组织结果  38-39
    3.9.2 间接免疫荧光方法检测肠系膜淋巴结结果  39-40
4 讨论  40-43
  4.1 原代细胞培养与 TGEV 的分离鉴定  40-41
  4.2 病毒分离培养的 RT-PCR 检测  41-42
  4.3 TGEV S 和 N 基因部分序列鉴定分析  42-43
5 结论  43-44
致谢  44-45
参考文献  45-50
附录  50-56
攻读硕士学位期间发表的学术论文  56

猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离及鉴定

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