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猪肌肉/肝脏特异性表达MyoD/BGL1载体构建及转基因小鼠的研究

作　者: 周鹏
导　师: 蒋思文
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 肌肉特异性表达肝脏特异性表达 CAPN3启动子 mfy6启动子 TTR启动子 MyoD BGL1 原核显微注射转基因小鼠
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本论文验证猪肌肉特异性基因CAPN3肝脏特异性基因TTR启动子的活性。采用猪肌肉特异性基因myf6的启动子与MyoD基因的CDS序列,构建在猪肌肉特异性高效表达MyoD的重组体；采用猪肝脏特异性基因TTR的启动子与BGL1基因的CDS序列,构建在猪肝脏特异性高效表达BGLl的重组体,之后通过显微注射制作转基因小鼠,为培育高产低耗转基因猪建立转基因模型。目前取得的主要研究成果：1)肌肉组织特异性表达基因CAPN3启动子的活性分析。在GeneBank数据库中筛选在猪肌肉组织特异性表达基因CAPN3及其DNA序列,取其翻译起始位点ATG上游2300bp为启动子序列作为研究对象,运用NNPP、 DNAman、ConSit进行序列的核心启动子区域、不同物种同源性、同源性最高的区域转录结合因子进行预测分析；据此,构建了8个缺失片段的荧光表达载体,分别转染C2C12、3T3、Hepal-6细胞,确定第3个缺失片段P3(-705-0)活性最高,并且具有较强的组织特异性。2)肝脏特异性表达基因TTR启动子的活性分析。在GeneBank数据库中筛选在猪肝脏特异性表达基因TTR,以翻译起始位点ATG上游2500bp序列作为研究对象,运用NNPP进行核心启动子区域的预测,得获四处评分较高的核心启动子区域,即以转录起始位点之前2205bp为启动子全长,构建荧光表达载体,分别转染C2C12,3T3, Hepal-6细胞,确定此全长启动子序列存在着较高的活性,从不同的细胞中荧光的表达水平来看,全长启动子序列也存在着很强的组织特异性。3)肌肉特异性表达载体pS V40-MYODEGFP-N1的构建及细胞水平验证肌肉特异性表达MyoD载体的构建,以真核表达载体pEGFP-N1为骨架,使用1422bp myf6基因的启动子(由本课题组保存)。先以Hind Ⅲ/Kpn Ⅰ双酶切MyoDCDS及pEGPF-N1载体,回收大片段,连接,得到中间载体pMYODEGFP-N1。然后用Sal Ⅰ/HindⅢ进行双酶切pMYODEGFP-N1载体和SV40-myf6的PCR回收纯化的序列,回收大片段,连接,得到最终表达载体pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1。经过PCR鉴定,酶切鉴定,测序无误,成功构建了肌肉特异性表达MyoD载体。细胞水平采用实时荧光定量PCR检测MyoD和EGFP的表达,试验组的MyoD mRNA表达量是对照组的8.04倍,试验组EGFP mRNA的表达量是对照组的6.80倍。4)肝脏特异性表达载体pTTRS-BGLhis-control的构建及细胞水平验证肝脏特异性表达BGL1载体的构建,以真核表达载体pGL3-control为骨架,从pMD-BGL1载体中扩增出BGL1CDS,设计引物的时候在BGL CDS末端加上6×his标签,Hind Ⅲ/Xba Ⅰ双酶切pGL3-control载体及BGL CDS,回收大片段,连接,得到中间表达载体pBGLhis-control。然后用Xho Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切中间载体pBGLhis-control,和扩增出的2221bp TTR基因启动子和信号肽序列,回收大片段,连接,得到最终表达载体。经过PCR鉴定,酶切鉴定,测序无误,即成功构建了肝脏特异性表达BGL1载体。并且在细胞水平检测到BGL1的表达。5)肌肉特异表达外源基因转基因小鼠的制备与鉴定将肌肉特异性表达载体pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1用Ase Ⅰ/AflⅡ双酶切进行线性化,回收3.5kb的目的条带,该序列存在着Svenhancer增强子、myf6基因启动子、MyoD与EGFP的融合蛋白基因编码序列及SV40Poly A序列这些元件,然后进行显微注射,得到PCR鉴定为阳性的转基因小鼠4只(1雄3雌)。

猪肌肉/肝脏特异性表达MyoD/BGL1载体构建及转基因小鼠的研究

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