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Plcd1转基因小鼠的建立

作　者: 杨伟伟
导　师: 邢华；吴宝金
学　校: 扬州大学
专　业: 基础兽医学
关键词: PLCD1 pEF6/V5-His-Plcd1 显微注射 转基因小鼠
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


PLCD1是Plcd1基因编码的蛋白,属于磷脂酶C家族δ亚型,在磷酸肌醇代谢和Ca2+平衡中发挥重要作用。我们的目标是建立Plcd1转基因小鼠,结合前期本实验室自主培育的Plcd1缺失小鼠snthr-1Bao,在整体动物水平研究Plcd1的生物学功能。本实验从Plcd1表达载体的构建和显微注射法制备Plcd1转基因小鼠两个方面介绍如下:第一部分pEF6/V5-His-Plcd1真核表达载体的构建目的:扩增Plcd1目的基因片段,获得能在哺乳动物细胞中表达PLCD1融合蛋白的表达载体。方法:通过RT-PCR方法获得Plcd1目的片段,将其与pMD19-T载体连接、转化DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选、PCR检测及DNA测序,获得pMD19-T-Plcd1重组质粒;以重组质粒为模板,通过引物设计及PCR方法在Plcd1目的基因两端引入合适的酶切位点,将纯化的PCR产物和pEF6/V5-His-LacZ表达载体分别进行酶切、纯化、回收、连接、转化DH5α感受态细胞,再经Amp筛选、PCR检测及DNA测序,获得pEF6/V5-His-Plcd1表达载体;在此基础上,通过电转染的方法,将pEF6/V5-His-Plcd1表达载体导入L929细胞,经间接免疫荧光法检测PLCD1融合蛋白的表达。结果:本实验成功扩增了长2271bp的Plcd1目的片段,将其与pMD19-T载体连接获得了pMD19-T-Plcd1克隆载体;以克隆载体为模板,通过PCR方法分别在Plcd1目的基因上下游引入了SpeI和BstBI两个酶切位点,PCR产物与pEF6/V5-His-Lac Z经酶切、回收、连接、转化、筛选及测序等一系列步骤,最终获得了pEF6/V5-His-Plcd1表达载体;电转染L929细胞后,经间接免疫荧光法检测到PLCD1融合蛋白在细胞质中表达。结论:本实验成功扩增了全长2271bp的Plcd1目的片段,并先后构建了pMD19-T-Plcd1克隆载体及能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白的pEF6/V5-His-Plcd1表达载体。第二部分显微注射法制备Plcd1转基因小鼠目的:在成功获得pEF6/V5-His-Plcd1表达载体的基础上,通过显微注射法获得Plcd1转基因小鼠。方法:pEF6/V5-His-Plcd1表达载体经酶切、电泳、纯化后,选择包括hEF-1α启动子、Plcd1目的片段、V5、His-tag和BGH的线性构件用于显微注射;供体、受体小鼠经同步发情或超排卵处理,采集受精卵用于显微注射;经显微注射后的受精卵适当培养,选择优质胚胎进行受体小鼠的输卵管移植;出生小鼠经基因组DNA提取及PCR检测,初步确认获得Founder转基因小鼠。结果:pEF6/V5-His-Plcd1经NruI和AseI双酶切纯化后,成功获得了用于显微注射的目的片段;显微注射共681枚受精卵,经培养后多数溶解,仅存活优质胚胎393枚,存活率为57.7%;存活胚胎全部用于移植,共移植了18只受体小鼠,13只小鼠怀孕,获得82只仔鼠。经PCR初步检测,成功获得了15只Plcd1转基因阳性小鼠,阳性率为18.3%。结论:经PCR检测,本实验初步获得了15只Plcd1转基因首建小鼠,为Plcd1基因功能的研究提供了新的动物模型。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-9
符号说明  9-10
文献综述  10-29
  1 PLCD1 和磷脂酶C  10-11
  2 PLCD1 的分子结构  11-14
  3 PLCD1 的分布  14-15
  4 PLCD1 的调节机制  15-17
  5 PLCD1 的生物学功能  17-23
  6 PLCD1 功能研究与小鼠模型  23-25
  参考文献  25-29
研究内容  29-54
  第一部分 pEF6/V5-His-Plcd1 真核表达载体的构建  30-46
    1 实验材料  30-31
    2 实验方法  31-40
    3 结果  40-45
    4 讨论  45-46
  第二部分 显微注射法制备Plcd1 转基因小鼠  46-54
    1 实验材料  46
    2 实验方法  46-50
    3 实验结果  50-52
    4 讨论  52-54
结论  54-55
参考文献  55-56
附录  56-60
致谢  60-61
攻读硕士学位期间发表的主要论文  61

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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