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草莓果实cDNA-AFLP技术体系构建及UFGT基因克隆

作　者: 陈琼娥
导　师: 潘东明
学　校: 福建农林大学
专　业: 果树学
关键词: 草莓（Fragaria ananassa Duch） 果实着色 花青苷 cDNA-AFLP 葡糖基转移酶 基因克隆
分类号: S668.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


草莓（Fragaria ananassa Duch），果实属小型浆果类，成熟早、色泽艳、营养高、香气浓，深受生产者和消费者欢迎，在世界范围内广泛栽种。‘法兰地’草莓品种是南方露天和大棚栽培的优良品种，颜色鲜红，果型美观，上市时间早。本试验研究了‘法兰地’草莓果实成熟过程中花青苷、多酚类物质、类黄酮物质、糖酸物质含量变化的关系；应用cDNA-AFLP技术研究分析草莓果实成熟过程中差异表达cDNA，并利用RACE克隆技术，获得草莓果实着色相关基因（UFGT），该基因是花青苷合成途径中最后一个关键性酶，主要作用是将糖基结合到不稳定的花色素上，从而使花色素变成稳定的花青苷，因此该基因的克隆对于草莓果实中花青苷合成调控及花青苷能源开发利用具有重要的意义。1、以花后15d、花后25d、花后30d、花后35d不同成熟度的‘法兰地’草莓果实为材料，比较了花青苷、类黄酮物质、多酚类物质、糖酸物质含量的变化。结果表明，随着草莓果实的不断成熟，酸度逐渐下降，糖含量逐渐增加；花青苷物质不断积累；在绿熟期，多酚类物质和类黄酮含量较高，此后呈现下降趋势，红熟期有上升趋势。2、优化了‘法兰地’草莓果实cDNA-AFLP反应体系，分离出草莓果实成熟过程中着色相关的差异cDNA。20μL体系中各成分用量及反应程序如下：模板用量为30ng、dNTP用量为0.1mmol/μL、引物用量为0.5μmol/μL、Ex-Taq酶用量为1U、Buffer为2μL， ddH2O为12.6μL，扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性30s；65℃退火30s（每循环降低0.7℃），72℃延伸80s，12个循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，进行25个循环，最后一个循环完成后72℃延伸7min结束。3、应用反向Northern杂交技术，对分离的差异TDFs进行假阳性验证，获得33个阳性差异cDNA片段。测序后同源性比对分析这些差异片段功能涉及RNA的转录、翻译；蛋白质的合成；蛋白质翻译及翻译后修饰；蛋白质衰老；萜类物质合成后修饰等等，其中N-乙酰基转移酶（Y1E0M3）、短链醇脱氢酶（Y3E5M4）、NAD+合成酶（Y3E0M1）、糖基转移酶（Y3E0M7）与草莓果实果皮着色密切相关。4、采用RACE技术，克隆‘法兰地’草莓果实果皮着色过程中UDP葡糖基转移酶基因全长。该基因全长1121bp，包含一个完整的开放阅读框851bp，编码276个氨基酸，其中5’为759个bp，3’为331个bp，与多种植物的该基因具有较高的同源性。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-15
第一章 前言  15-27
  1 果实着色研究  15-17
    1.1 花青苷的基本结构和种类  15-16
    1.2 花青苷在果实中的分布  16-17
  2 果实中花青苷研究进展  17-22
    2.1 花青苷生物合成途径  17-18
    2.2 花青苷合成的结构基因  18-20
      2.2.1 PAL  18-19
      2.2.2 CHS 和 CHI  19
      2.2.3 UFGT  19
      2.2.4 其他  19-20
    2.3 花青苷合成的调节基因  20
    2.4 外界环境等因素对花青苷合成的影响  20-22
      2.4.1 光照  20-21
      2.4.2 温度  21
      2.4.3 矿质元素  21
      2.4.4 激素  21-22
      2.4.5 糖、酸等  22
  3 cDNA-AFLP 差异显示技术研究进展  22-24
    3.1 cDNA-AFLP 技术原理及特点  22-23
    3.2 cDNA-AFLP 技术在分离差异表达基因上的应用  23-24
  4 立项意义  24-25
  5 研究内容及技术路线  25-27
    5.1 研究内容  25-26
    5.2 技术路线  26-27
第二章 ‘法兰地’草莓果实着色相关生理生化指标的测定  27-33
  1 材料与方法  27-29
    1.1 试验材料  27
    1.2 试验方法  27-29
      1.2.1 可溶性糖含量的测定  27-28
      1.2.2 可滴定酸含量的测定  28
      1.2.3 花青苷含量的测定  28
      1.2.4 类黄酮物质含量的测定  28-29
      1.2.5 酚类物质含量的测定  29
  2 结果与分析  29-32
    2.1 草莓成熟过程中可溶性糖、酸含量的变化  29-30
    2.2 草莓果实成熟过程花青苷含量的变化  30
    2.3 草莓果实成熟过程类黄酮物质含量的变化  30-31
    2.4 草莓果实成熟过程酚类物质含量的变化  31-32
  3 讨论  32-33
第三章 ‘法兰地’草莓果实 cDNA-AFLP 技术体系的构建  33-50
  1 材料  33-34
    1.1 试验材料  33
    1.2 主要仪器、设备  33
    1.3 主要试剂  33
    1.4 所用引物  33-34
  2 试验方法  34-41
    2.1 总 RNA 的提取与检测  34-36
      2.1.1 无菌、无 RNase 环境的创造  34-35
      2.1.2 总 RNA 的提取  35
      2.1.3 总 RNA 的检测  35-36
    2.2 cDNA 的合成  36-37
      2.2.1 cDNA 第一链的获得  36
      2.2.2 cDNA 第二链的合成  36
      2.2.3 cDNA 片段的纯化与检测  36-37
    2.3 cDNA 的酶切及连接  37-38
    2.4 预扩增  38
    2.5 选择性扩增  38-39
    2.6 PCR 扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳  39-41
      2.6.1 电泳玻璃板的准备及组装  39
      2.6.2 聚丙烯酰胺凝胶的制备及灌胶  39-40
      2.6.3 扩增产物凝胶电泳  40
      2.6.4 银染显色  40-41
  3 结果与分析  41-48
    3.1 总 RNA 的提取  41-42
    3.2 双链 cDNA 质量  42
    3.3 预扩增  42-43
    3.4 反应体系中各因子对选择性扩增的影响  43-46
      3.4.1 cDNA 模板用量对选择性扩增的影响  43-44
      3.4.2 dNTP 浓度对选择性扩增的影响  44-45
      3.4.3 引物浓度对选择性扩增的影响  45-46
      3.4.4 Ex-Taq 酶浓度对选择性扩增的影响  46
    3.5 部分选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶图谱  46-48
  4 讨论  48-50
    4.1 草莓果实总 RNA 的提取  48
    4.2 选择性扩增体系  48
    4.3 cDNA-AFLP 试验注意事项  48-50
第四章 差异片段的分离、验证与分析  50-62
  1 试剂  50
  2 试验方法  50-55
    2.1 差异片段的分离  50-51
      2.1.1 差异片段的回收  50
      2.1.2 差异片段的二次 PCR 扩增  50
      2.1.3 二次扩增产物的回收  50-51
    2.2 差异片段 cDNA 阳性验证  51-54
      2.2.1 杂交相关溶液的配制  51
      2.2.2 探针的制备  51-52
      2.2.3 探针效率的检测  52-53
      2.2.4 反向 Northern 杂交  53-54
    2.3 差异片段的分析  54-55
      2.3.1 目的片段的连接  54
      2.3.2 连接产物的转化  54
      2.3.3 菌液 PCR 检测  54-55
  3 结果与分析  55-60
    3.1 差异片段的二次 PCR 扩增  55
    3.2 差异片段的反向 Northern 杂交  55-57
      3.2.1 探针效率检测  56
      3.2.2 杂交结果分析  56-57
    3.3 测序结果分析  57-60
  4 讨论  60-62
    4.1 反向 Northern 杂交注意事项  60-61
    4.2 阳性验证分析  61
    4.3 测序结果分析  61-62
第五章 草莓果实着色基因 UFGT 的克隆与分析  62-75
  1 材料  62
    1.1 植物材料  62
    1.2 仪器设备  62
    1.3 试剂  62
    1.4 引物合成与测序  62
  2 方法  62-68
    2.1 总 RNA 的提取及检测  62
    2.2 总 RNA 的逆转录  62-64
      2.2.1 3'-RACE-Ready cDNA 的合成  62-63
      2.2.2 5'-RACE-Ready cDNA 的合成  63-64
    2.3 UFGT 基因的 3'-RACE  64-66
      2.3.1 引物设计  64
      2.3.2 第一轮 PCR 扩增  64-65
      2.3.3 第二轮 PCR 扩增  65-66
      2.3.4 目的片段的回收  66
      2.3.5 目的片段的连接转化与验证  66
    2.4 UFGT 基因的 5'-RACE  66-67
      2.4.1 引物设计  66
      2.4.2 5 '末端的第一轮 PCR 扩增  66
      2.4.3 第二轮 PCR 扩增  66-67
      2.4.4 目的片段的回收  67
      2.4.5 目的片段的连接转化与验证  67
    2.5 UFGT 基因的 ORF 扩增  67-68
      2.5.1 引物设计  67
      2.5.2 UFGT 基因的 ORF 扩增  67-68
      2.5.3 目的片段的回收  68
      2.5.4 目的片段的连接转化与测序  68
    2.6 生物信息学分析  68
  3 结果与分析  68-73
    3.1 UFGT 基因部分序列  68
    3.2 草莓果实 UFGT 基因的 3'-RACE  68-69
    3.3 草莓果实 UFGT 基因的 5'-RACE  69-71
    3.4 草莓果实 UFGT 基因 cDNA 全长的获得  71-72
    3.5 草莓果实 UFGT 基因的 ORF 扩增  72-73
    3.6 生物信息学分析  73
  4 讨论  73-75
第六章 小结  75-76
参考文献  76-84
附录  84-90
致谢  90

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类 > 草莓
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